密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒 (ILTV)糖蛋白gB基因 ,通过EcoRI位点亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中 ,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB。将rpVLgB转移载体质粒与杆状病毒DNA(Bac_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经 3轮蚀斑纯化 ,获得重组病毒并命名为rpVL_ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中 ,直接免疫荧光试验和Dot_ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达 ,表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。

猪γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有猪γ-干扰素(porcine interferon-γ,PoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-PoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-PoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达PoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ。以抗PoIFN-γ单克隆抗体为一抗进行Western blot、间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,结果表明PoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ感染的昆虫细胞中获得正确表达。抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达rPoIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在猪肾细胞系(PK-15)的复制,rBac-PoIFN-γ感染昆虫细胞培养上清抗病毒活性为2×104抑制单位(IU)/mL,其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组PoIFN-γ免疫血清有效阻断。结果表明rPoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-PoIFN-γ在感染昆虫细胞获得有效表达,并具有高效抗病毒活性。

牛γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及其抗病毒活性的测定

研究利用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有牛γ-干扰素(Bovine interferon-γ,BoIFN-γ)完整开放阅读框的供体质粒pFastBacTM1-BoIFN-γ,转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒rBacmid-BoIFN-γ,转染sf9昆虫细胞救获表达BoIFN-γ的重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ。采用抗BoIFN-γ单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,表明BoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ感染的sf9昆虫细胞中获得正确表达。利用VSV*GFP-MDBK细胞系统测定rBoIFN-γ抗病毒活性,重组杆状病毒表达重组BoIFN-γ(rBoIFN-γ)能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上的复制,rBac-BoIFN-γ感染sf9昆虫细胞上清抗病毒活性为2×105IU/mL,而且其抗病毒活性可以被鼠抗原核表达重组BoIFN-γ免疫血清阻断。结果表明:rBoIFN-γ在重组杆状病毒rBac-BoIFN-γ感染的sf9昆虫细胞中获得良好表达,并具有高效抗病毒活性。

重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)的杀虫活性和安全性初步研究

苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒作为新型生物杀虫剂已应用于农作物病虫害防治。对构建的重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)进行了杀虫活性和生物安全性初步研究。结果显示,重组病毒和野生型病毒的LC50分别为7.5×102,3.3×104PIBs/mL,重组病毒比野生型病毒具有更好的杀虫活性;检测了该重组病毒和野生型病毒对小鼠的易感性,所试小鼠未见明显急性毒性反应,高剂量重组病毒灌胃小鼠的脾脏增大,小鼠胸腺、脾、肾组织切片未有异常,重组病毒对小鼠具有较高的生物安全性。

鸡γ-干扰素在重组杆状病毒中的表达及抗病毒活性的测定

本研究构建了表达鸡γ-干扰素(Chicken interferon-γ,ChIFN-γ)的重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ。采用鼠抗ChIFN-γ免疫血清作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)及间接ELISA检测,表明ChIFN-γ在重组杆状病毒rBac-ChIFN-γ感染的昆虫细胞中获得表达。细胞病变抑制法测定重组ChIFN-γ抗病毒活性试验显示,重组杆状病毒表达ChIFN-γ能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的复制,而且其抗病毒活性可以被鼠抗ChIFN-γ免疫血清阻断。试验结果表明,重组杆状病毒能良好表达ChIFN-γ,并具有高效抗病毒活性。

禽流感病毒核蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法成功地扩增了我国禽流感病毒分离株Ａ／Ｘｉｎｇｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）的核蛋白（ＮＰ）基因，其限制性内切酶图谱和核苷酸序列与鸭源的标准Ｈ１４Ｎ５毒株几乎完全一致，与其它毒株则有较大差异，说明该鸡源分离株与鸭源毒株有非常近的亲缘关系。将ＮＰ基因定向克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中，再与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－ＢｌｕｅＤＮＡ）共转染于Ｓｆ９昆虫细胞中，经过三次蚀斑筛选，获得重组病毒ｒＢ２。用其细胞表达产物裂解后作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ和ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ，结果表明ＮＰ基因在杆状病毒系统中获得了表达。同时用表达产物作琼脂扩散试验，结果表明表达产物与现行标准禽流感琼扩抗原具有相同的生物学活性。

温度和pH值对重组杆状病毒(AcMNPV-BmKIT-Chi)的毒力影响

研究了温度、酸碱度对重组杆状病毒（AcMNPV—BmKIT-Chi）毒力的影响．结果显示，多角体病毒在温度4～50℃，pH6．0～8．0范围内可以保持较高的毒力稳定性；不同虫龄棉铃虫幼虫对重组病毒的毒力敏感性差异显著，低虫龄对重组核型多角体病毒更为敏感；病毒对幼虫存在亚致死作用，饲毒组与对照组幼虫体重差异显著．

昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望

本文综述了昆虫重组病毒获得技术的研究进展以及在生产应用上的改进 。

重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究

本研究构建了表达牛β干扰素的重组杆状病毒,感染sf9细胞后,分别采用免疫荧光和免疫印迹证实了重组BoIFN-β的表达存在于细胞内和培养上清中。采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV*GFP)检测分泌到细胞上清中重组BoIFN-β的抗病毒活性,可达到106.0AU/mL。同时重组BoIFN-β还可以激活鸡Mx启动子控制的萤光素酶报告基因的转录表达。综上,本研究采用杆状病毒表达系统,重组牛β干扰素以分泌形式高水平表达,且具有天然Ⅰ型干扰素的生物学活性。

口蹄疫病毒2C′3AB基因重组杆状病毒的构建及其表达

将含有口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白2C部分基因编码区及3AB完整基因编码区的基因片段2C′3AB重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac-B,经PCR、酶切及序列分析鉴定正确后,命名为pMel-2C′3AB。将重组穿梭质粒pMel-2C′3AB与杆状病毒骨架共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选及PCR鉴定,构建了含有目的基因的重组杆状病毒。用该病毒感染High Five细胞,细胞裂解液的SDS-PAGE电泳结果显示,出现一约为43ku的蛋白带,与预期大小一致;Western-blotting结果表明,该表达产物能被FMDV阳性血清及2C′3AB单克隆抗体识别;间接ELISA结果显示,表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应。证实,FMDV 2C′3AB基因在昆虫细胞中得到了表达,且表达产物具有良好的反应活性。

gfp基因标记的重组杆状病毒对棉铃虫幼虫的侵染历程

用携带杆状病毒极晚期多角体蛋白基因启动子驱动gfp表达的重组病毒rHa FGP感染棉铃虫三龄幼虫 .在感染后不同时间取样 ,分离不同组织 ,制片 ,置于倒置荧光显微镜下观察基因的表达 .结果发现 ,随着感染时间的推移 ,荧光产生的部位出现更替 ,随后荧光强度也发生相应的变化 .从荧光出现的先后初步推断出杆状病毒对昆虫幼虫的侵染路线 :中肠上皮→血淋巴→气管系统→脂肪体 真皮 .在幼虫感染后 12h荧光即出现于中肠细胞中 ,表明此时已有极晚期蛋白表达 .说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因 (cry)表达 。

表达PCV2 Cap蛋白重组杆状病毒对小鼠的保护力试验

PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBac-Cap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白。动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力。

重组杆状病毒表达的2株传染性支气管炎病毒S1蛋白的免疫原性评价

利用 Bac- to- Bac杆状病毒表达系统构建了 2株重组杆状病毒 r Ac JS95 0 3S1和 r Ac SD970 1S1,分别表达了 2株致病性不同的传染性支气管炎病毒的 S1基因。用感染重组杆状病毒的昆虫细胞裂解液对 2周龄的伊莎公雏进行免疫 ,根据鸡免疫后的抗体水平动态变化和攻毒后鸡肾脏和气管的保护力判定它们的免疫原性。结果显示 ,重组杆状病毒表达的 IBV S1蛋白可以诱导抗体产生和免疫保护反应 ,2毒株间也存在着一定程度的交叉免疫保护反应。

共表达O型口蹄疫病毒P12A＋3C基因的重组杆状病毒的构建

构建共表达O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C的重组杆状病毒,为进一步研究FMDV空衣壳抗原和基因工程亚单位疫苗奠定基础。从质粒T-OP1中扩增出编码O型FM-DV衣壳蛋白前体的P12A基因,并将其插入到杆状病毒转移载体pFastDual-3C的PH启动子之下,构建重组杆状病毒转移载体pD-P12A3C。通过在大肠杆菌内转座重组,获得重组杆粒B-P12A3C,转染Sf9细胞,获得表达O型FMDV衣壳蛋白的重组杆状病毒。重组杆状病毒经增殖并感染Sf9细胞后,通过双抗体夹心ELISA方法及间接免疫荧光来检测目的蛋白的表达。结果表明,表达产物能被O型FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性,表明重组杆状病毒构建成功,该研究为O型FMDV空衣壳的体外组装及基因工程亚单位疫苗的研究提供了前期材料。

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。

介导分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建

应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代ORF2原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Westernblot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达.

重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的 :构建新型的马传染性贫血病毒 (EIAV)的候选疫苗。方法 :利用BAC To BAC杆状病毒表达系统 ,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗 (EIAVDLV)及其亲本株 (EIAVLN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后 ,得到的重组病毒用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒 ,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果 :构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比 ,联合免疫组免疫应答显著增强 ,其中中和抗体的滴度提高5～ 9倍。结论 :含有EIAVenv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫 ,能够诱导高滴度的中和抗体。

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。