布鲁氏菌病疫苗免疫评估与野毒感染区分试验

为评估布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)的安全性和免疫效果,在华池县选取阴性、阳性羊群各一群,以腿部皮下注射的方式免疫接种布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株),免疫接种后30 d、90 d、120 d、150 d、180 d分别采集血清样品,用虎红平板凝集试验和试管凝集试验开展免疫效果评估,统计抗体转阳率、转阴率等指标。结果显示,M5-90△26株免疫接种30d后抗体达到峰值,以后逐渐下降,免疫90d后转阴率在80%以上,说明该疫苗具有免疫效果好、保护率高、转阴快等优点。布鲁氏菌基因缺失活疫苗(M5-90△26株)中敲除bp26基因,用布鲁氏菌病LPS和BP26蛋白ELISA抗体检测试剂盒可以对疫苗免疫阳性和野毒感染进行区分,能够为布鲁氏菌病检疫、净化提供依据,为华池县布鲁氏菌病防控提供更多参考。

猪伪狂犬疫苗C株在伪狂犬野毒阳性场的免疫策略与净化思路

伪狂犬野毒株gE阳性猪场,在商品猪育肥过程中经常出现呼吸道疾病反复高发现象,不仅造成育肥期投药成本高,且在继发感染严重时极易出现高死亡率,对规模猪场造成严重经济损失。在本案例中该猪场为伪狂犬野毒株gE阳性,一直免疫传统Barth-K61毒株疫苗,但在120日龄以上商品猪育肥期经常出现呼吸道系统疾病,经检测分析判定为伪狂犬病与传染性胸膜肺炎混合感染,投药效果不理想。2021年11月在育肥区选用美保龙生物伪狂犬C株疫苗与传统Barth-K61毒株作平行对比发现,美保龙伪狂犬C株组157日龄育肥猪有1头gE抗体阳性、1头可疑;传统Barth-K61毒株组141日龄、152日龄育肥猪gE抗体全为阳性。说明美保龙伪狂犬C株疫苗保护时间长,保护期可至育肥后期。该养殖场于2022年开始全面使用美保龙伪狂犬C株疫苗,西育肥区2023年第1季度检测结果显示120日龄以上育肥猪gE抗体均为阴性,东育肥区推迟了免疫时间导致120日龄以上育肥猪gE抗体均为阳性,此案例证明临床伪狂犬防控不仅需要优质的疫苗还需要科学合理的免疫程序,也为该场下一步对伪狂犬全面净化打下坚实基础。

PCV3吉林野毒株全基因组序列分析及其Cap蛋白的亚细胞定位

为了研究吉林省猪圆环病毒3型(PCV3)野毒株遗传变异情况及其衣壳蛋白(Cap)的亚细胞定位特征,本试验对收集到的10株PCV3吉林野毒株进行全基因组序列测定和分析,并构建真核表达载体pcDNA3.1V5/HisA-Cap转染猪肺巨噬细胞(PAM);继而用本实验室已构建的兔源PCV3-Cap多克隆抗体,通过激光共聚焦检测Cap蛋白在PAM中的定位。序列分析结果显示,10株PCV3吉林野毒株与国内外参考株之间的全基因组核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,处于PCV3a和PCV3b两个亚群;基因重组分析结果显示,仅中国参考株MF589102(2016年)、MH445396(2019年)和分离株JL-2在80~303 nt、840~1196 nt和1885~2001 nt处发生3处重组。激光共聚焦检测结果显示,Cap蛋白大部分定位于细胞核,少部分定位于细胞质。结果表明,目前吉林省PCV3比较保守,没有出现较大变异,Cap蛋白在PAM的细胞核和细胞质中均有分布。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白原核表达及野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种简单、快速的猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒抗体检测方法,试验采用原核表达技术对PRV流行毒株的gE蛋白进行了原核表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了检测PRV野毒抗体的间接ELISA检测方法。结果表明:获得了以包涵体形式表达的重组gE蛋白,经Western blot鉴定表明重组gE蛋白具有良好的免疫学活性,以该蛋白作为包被抗原建立的检测PRV野毒抗体的间接ELISA方法检测PRV疫苗免疫血清、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV、FMDV阳性血清均为阴性,检测PRV野毒阳性血清的最低检出效价为1∶10240,批内和批间重复性试验的变异系数分别为2.19%~3.33%和3.01%~4.40%,与国外商品化gE-ELISA试剂盒的符合率达98.72%,应用该ELISA检测河南省部分地区采集的1128份猪血清样品,PRV野毒抗体阳性率为8.07%。说明建立的PRV野毒抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,为PRV野毒抗体的流行病学监测和净化提供了技术支持。

猪蓝耳病阴性猪场野毒感染后处理的经济学思考

猪蓝耳病病毒变异快,且多种毒株并存,疫苗保护效果差。当前越来越多的种猪场完成了猪蓝耳病的净化工作,但净化后维持难度较大。该文报道猪蓝耳病阴性种猪场在日常监测中发现感染猪蓝耳病JXA1-like野毒株,通过采用紧急返饲的方法,并强化猪场生物安全、加强猪群中西药保健、提升猪群健康度等措施,能快速将本次发病控制下来。当猪蓝耳病阴性场转阳后如何处置,兽医需从经济学的角度去做防控和净化的决策。采用未来收益折算为净现值评估的方法,得出本次投入收益比为1∶3.3,说明本次通过返饲的处理方法是经济可行的。

鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒（PRV）gH、gE基因的序列，设计了两对引物及其对应的TaqMan探针，通过对引物、探针、Mg2＋的浓度和样品DNA提取方法等进行优化，建立了鉴别PRV野毒与疫苗毒感染的荧光定量PCR方法。该方法线性范围为10^1-10^8拷贝／μL，达8个数量级，灵敏度可达10^1拷贝／μL，比常规PCR高100倍。用此方法对60份疑似组织样品进行检测，并与血清中和试验、常规PCR相比较，结果显示该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点，并且该法以闭管的模式操作，减少了后续步骤污染的可能性，整个PCR检测过程不到2h。此方法的建立，为猪伪狂犬病病毒的早期鉴别诊断和定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。

猪瘟病毒强弱毒株和野毒株E2全基因序列测定及比较分析

为了比较猪瘟病毒 (HCV)野毒株、疫苗株及标准株之间E2基因抗原区域的差异 ,采用RT PCR扩增了HCV石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒 0 3及 0 7株的囊膜糖蛋白E2 (gp55)全基因的cDNA片段 ,分别克隆于pGEM T载体中并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列的推导 ,同时进行了同源性比较及E2结构与功能的分析。所测 4株HCVE2基因的长度均为1 2 73bp,所编码的氨基酸序列均包括部分信号肽序列和完整的跨膜区序列 ,共由 381个氨基酸组成 ;4个毒株E2蛋白N末端的 683位至 690位信号肽序列 (WLLLVTGA)和C末端 1 0 30～1 0 63位跨膜区均为保守序列 ,而且具疏水性 ;N末端抗原功能区中 ,4个E2蛋白与其它所比较序列在位于第 753位至 759位氨基酸处 ,均有一段保守序列RYLASLH ,无一氨基酸发生变异 ,为亲水性 ,在整个E2蛋白抗原谱中抗原性峰值为最高 ,推测对抗原性产生起重要作用 ;4个E2蛋白的氨基酸序列中均含有 1 5个半胱氨酸 (Cys)残基 ,其数量及位置与国外五株HCV(Brescia ,C ,Alfort.ALD和GPE)完全一致。表明该 4株HCVE2抗原具有相同的构型 ,尤其是N末端的 6个Cys残基对E2蛋白结构的正确折叠及特异抗原决定簇的形成至关重要。同时对主要抗原区域氨基酸位点变异进行分析 ,发现疫苗株与野毒株之间抗原决定簇未发生明显变?

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。

PCR方法检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型野毒株的研究

用聚合酶链反应试验（ＰＣＲ）检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（ＰＶＩ）野毒株，仅需５μｌＰＶＩ细胞培养液，方法简便、快速、敏感、特异，用本法对我国１４个省市７９份ＰＶＩ分离株的检测结果，能与检定ｓａｂｉｎⅠ相关株的ＳＩ／ＰＣＲ法的检测结果相印证，与其中３１份核苷酸测序判断为野毒株的结果相一致。其检测阳性率为８４．４％，基本能检测我国流行过的５个ＰＶＩ基因型野毒株。另外，从检测结果看，除北京市未发现野毒株外，其它１３个省区都有野毒株流行，表明当前我国消灭脊灰的任务还很重。

猪伪狂犬病病毒gE蛋白在野毒诊断中的应用进展

猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因缺失弱毒疫苗在中国的大规模免疫应用,对预防和控制猪伪狂犬病(pseudorabies,PR)起到了重要作用,同时亟需建立与gE基因缺失弱毒疫苗配套的鉴别诊断技术,淘汰净化野毒感染猪,减少免疫猪被误杀的可能,逐步实现PRV的净化。随着分子生物学与免疫学技术的日臻进步,基于PRV gE蛋白的分子生物学和血清学诊断方法不断发展与完善。文章就近年来基于gE蛋白的各种分子生物学和血清学诊断方法的最新研究现状及发展前景进行综述,以期为中国PRV的诊断与防控提供科学依据。

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用BstDNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果。该方法可检测出不同基因型的CSFV野毒株,其检出极限为2.5TCID50的CSFV,与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率达100%,与引物-探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%。该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法。

用地高辛标记的核酸探针检测猪伪狂犬病毒野毒感染的研究

利用PCR技术从带有伪狂犬病毒(PRV)gE基因的重组质粒pMD18-T-gE中扩增回收约304 bp大小的片段,并制备出地高辛标记的gE基因核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与重组质粒DNA发生特异性杂交,而与对照的PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、猪细小病毒(PPV)DNA、猪圆环病毒(PCV)DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)cDNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA的杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对PRV野毒的最低检出量为4 pg。应用该探针对11份繁殖障碍病料进行了杂交检测,共检出4份阳性病料,该结果与PCR检测结果一致,表明该核酸探针可用于猪伪狂犬病野毒感染的临床诊断。

猪瘟兔化弱毒抗体对不同野毒株体内外中和保护试验的相关性研究

将猪瘟兔化弱毒疫苗阳性血清与猪瘟野毒株HeBZJK1.95、GZGD1.95、HeBHH2.95、BJXC1.95、HeNBY1.96、BJCY1.96、BJSY2.96、BGTX3.96、HeNXH2.98、FJFQ1.99、JL1.94和标准石门株在PK-15单层细胞上进行中和试验,测定了猪瘟病毒抗体在体外对野毒株的中和作用能力.结果表明,阳性血清对HeBZJK1.95、GZGD1.95、B.JSY2.96、JL1.94和石门株的中和效价为1:256,对BGTX3.96株为1:128,对HeBHH2.95、BJCY1.96、HeNXH2.98株为1:64,对BJXC1.95株为1:16,对FJFQ1.99株为1:8,对HeNBY1.96株为1:4.由此表明,对不同毒株血清中和效价不同.另外测定了猪体内免疫抗体与免疫保护力的关系.采用1头份猪瘟兔化弱毒疫苗主动免疫没有母源抗体的猪,免疫后14 d和192 d抗体滴度<1:16,攻击野毒HeNXH2.98株,仔猪能够完全保护.采食初乳的2组仔猪,母源抗体滴度为<1:16～1:64,分别免疫2头份和4头份猪瘟兔化弱毒疫苗,免疫后抗体滴度均下降1～2个滴度(1头母源抗体滴度低的仔猪,免疫4头份后由<1:16达到1:16).攻击野毒HeNXH2.98株后,免疫2头份的仔猪,不管免疫后抗体水平多高(<1:16～1:64),均不完全保护;免疫4头份的仔猪,免疫后抗体滴度较低(1:8)时,不完全保护;抗体滴度≥1:16时,能够完全保护.动物免疫保护试验表明,1头份疫苗免疫抗体水平能起到良好攻毒保护作用,但母源抗体会影响疫苗免疫抗体水平和攻毒保护效果.

应用复合多聚酶链反应方法快速鉴别伪狂犬病弱毒疫苗与野毒

本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计并合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２），以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼脂糖凝胶电泳显示，从所有１１株野毒ＤＮＡ中都扩增出３７２ｂｐ和５２６ｂｐ两个片段，而Ｂａｒｔｈａ－ｋ６１只扩增出３７２ｐｂ一个片段。酶切分析证明ＰＣＲ产物是特异性的。ｇＢ基因是ＰｒＶ主要保护性抗原基因，是病毒复制必需的，强弱毒都有此基因；Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株是ｇＥ基因缺失的弱毒。所以，本实验建立的方法通过１次ＰＣＲ即可有效鉴别疫苗毒与野毒。这一方法将在今后根除伪狂犬病计划中发挥重要作用。

猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。

闽西地区猪伪狂犬野毒株感染的血清学调查

美国IDEXX公司生产的PRV-gE（gE-ELISA）酶联免疫试剂盒,能对已免疫PR缺失gE的基因工程疫苗或未免疫的猪群,区分疫苗株和野毒株感染。2005～2007上半年,对闽西地区使用gE-基因缺失疫苗的规模化猪场母猪、仔猪和生长猪,不分健康状况,进行PR野毒株感染的血清学调查,结果显示2005年至2006年上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率较高,达41.5%和43.8%,2006年下半年至2007上半年,该地区母猪PR野毒感染阳性率有较大幅度的降低,且阴性猪场很多,阳性率分别是21.3%和13.3%。同时3年来对54个规模化猪场监测结果分析,各猪场阳性率差异很大,3年来猪场阳性率也呈大幅度下降,2007年上半年猪场阳性率仅为33.3%。对仔猪和生长猪的监测结果显示,阳性率比母猪大大降低,并且也呈下降的趋势。

GPV野毒株的分离及PCR检测方法的应用

在本实验中 ,用根据CPVHl标准毒核苷酸VP1_VP3和VP3两个区段基因序列设计的 2对特异性引物GRPl/GRP2和GFl/GF2 ,用该 2对引物对从鹅细小病毒野毒感染的病鹅分离的GPV野毒株进行PCR检测 ,结果 2对引物GRPl/GRP2和GFl/GR2 ,均能特异性地扩增出与预期片段大小相符的 0 .6bp和 1.6bp两个片段。回归试验的结果表明 ,该GFV野毒株的感染潜伏期为 8d ,病程为 1～ 3d ,致死率达 10 0 %。

猪瘟野毒混合毒实验室感染的研究

本研究以本所近年来所分离的高、中、低三株不同毒力 (HeNXH3.98、JL1 94和FJFQ1 99)的猪瘟野毒混合毒对敏感猪进行实验室感染试验 ,利用HCFA、RT_PCR及序列测定进行检测和分析 ,结果 2头试验猪均在感染后 2周发病死亡 ,表现典型的猪瘟临床症状 ;序列测定及分析结果表明感染后 1周及 2周 2头实验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列完全一致 ,核苷酸及氨基酸同源性均为 10 0 % ;与感染毒株序列比较 ,2头试验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列与JL1 94株序列完全一致 ,核苷酸及氨基酸同源性均为 10 0 % ,且基因分群在同一群 ;而与HeNXH3.98和FJFQ1 99株序列则有一定的差异 ,且不在同一基因群或基因亚群。说明在多个猪瘟病毒存在的情况下 ,敏感猪存在对猪瘟病毒的优势选择。本试验的条件下 3株不同毒力的猪瘟野毒混合感染以中等毒力毒株JL1