基于裁剪适配体的纳米金比色法用于金黄色葡萄球菌肠毒素A的可视化检测

目的:筛选适配体作为分子识别原件,基于纳米金的盐效应构建生物传感器,实现金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)的快速定量检测。方法:采用分子对接和分子动力学模拟对SEA适配体进行截短指导和结果预测,利用纳米金显色法验证模拟结果,对SEA适配体优化并将其作为分子识别原件,优化反应体系,探讨SEA质量浓度与吸光度比值间的关系,构建一种可视化的SEA快速检测分析方法,并对方法的准确度、精密度和特异性进行评价。结果:筛选出一条序列短、亲和力高、特异性强且稳定的SEA适配体,建立了一种基于纳米金比色的SEA可视化检测方法,检出限低,加标回收结果满意。结论:采用分子模拟能有效提高适配体筛选效率,本方法可用于SEA快速检测。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株 (Staphylococcusaureus,ATCC13 5 65 )中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因 ,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pET SEA并获得高效表达 ,重组蛋白 (rSEA)在 3 7℃诱导时以包涵体形式存在 ,降低温度则出现可溶表达 ,可溶性rSEA占总rSEA的 5 5 %。可溶性rSEA经Ni2 + 亲和层析纯化 ,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较 ,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了 9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论 :将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养 ,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养 。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对人外周血T细胞活化作用的观察

目的 观察超抗原对外周血T细胞的活化作用。方法 用不同浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)刺激人外周血T细胞,观察细胞增殖、IL-2的产生及细胞表型情况。结果 当SEA为1μg/ml时,T细胞表现了最大的增殖活性;SEA对CD4+、CD8+T细胞有同等活化作用;IL-2在培养后的48～72,小时产生的量最大。结论 SEA对外周血T细胞有明显的促增殖作用。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因全序列的克隆、鉴定与扩增

目的克隆SEA基因作为后续基因治疗的目的基因。方法以金黄色葡萄球菌基因组DNA(ATCC— 1 35 6 5 )为模板 ,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因特异性引物为介导 ,采用普通PCR和降落PCR方法分别克隆SEA基因全序列 ,克隆入T载体后进行DNA测序。结果 2 %琼脂糖凝脂电泳和DNA测序证实该基因克隆成功。结论通过PCR方法 。

IL-2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达

目的 :IL - 2与金黄色葡萄球菌肠毒素A和B融合基因的克隆及表达。方法 :分别在金黄色葡萄球菌肠毒素A2 2 7Ala、B基因的两端克隆上两个酶切位点HindⅢ ,KpnⅠ。将IL - 2基因突变 ,设计一段linker使之分别与SEA2 2 7Ala和SEB相连并克隆到PET表达载体中 ,在大肠杆菌DH5α(DE3) -Pass中表达。结果 :表达的蛋白占总蛋白 15 %。结论 :IL -

金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法的建立及其应用（英文）

目的建立一种敏感、特异、便捷的方法,用于检测食源性金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)。方法采用经典的细胞融合技术制备抗SEA的单克隆抗体,亲和层析纯化抗体蛋白,ELISA方法测定抗体滴度,免疫层析分析抗体亚型。以抗SEA单抗为一抗,建立Western印迹法,检测不同食物样品中的SEA。结果筛选出3株抗SEA的单抗,命名为SEA-7,SEA-18和SEA-86。纯化后的3株单抗纯度均>90%,抗体滴度均在1∶32 000,经鉴定均为IgG1亚型。利用3株单抗建立检测SEA的Western印迹法,SEA-7的检测灵敏度最高,可达1.56 ng。以SEA-7为一抗,可检测出不同食物中污染的SEA,如污染了1.56 ng SEA的水,污染了5 ng SEA的粥或火腿肠匀浆。结论建立的检测SEA方法可靠灵敏,可用于监测食源性金黄色葡萄球菌污染。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对T淋巴细胞分化的作用

目的:探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(stapylococoal enterotoxin A,SEA)对T淋巴细胞亚群Tc/Th细胞增殖的不同影响。方法:以SEA刺激脐带血单个核细胞(CBMCs),以3H-TdR掺入法及ELISA法检测Tc/Th细胞对SEA刺激的反应。结果:经SEA刺激后,CBMCs中的Tc0/Th0增殖并向Ⅰ型或Ⅱ型分化。在较低浓度SEA刺激时,CBMCs分泌IL-10的比例高于γ-IFN;而经较高浓度SEA刺激后,CBMC分泌γ-IFN的比例高于IL-10。结论:SEA在较低浓度刺激时,诱导T淋巴细胞向Tc1/Th1的分化;而较高浓度时,在促进T细胞增殖的同时,可以诱导T细胞向Tc2/Th2的分化。

因子Ⅶ-金黄色葡萄球菌肠毒素A融合蛋白的抗肿瘤效果

目的研究鼠因子Ⅶ（mfⅦ）与金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）融合蛋白的抗肿瘤生长和转移活性。方法构建表达Ⅶ因子-SEA融合蛋白的腺病毒载体，用293包装细胞系制备病毒Ad／mfⅦ-SEA。局部荧光检测证明其表达能力和安全性后，直接应用病毒感染的293细胞以皮下注射的方式进行试验。采用小鼠205H12肺转移模型和小鼠RM-1皮下肿瘤模型检测mfⅦ-SEA对小鼠皮下肿瘤生长和肺转移形成抑制情况。结果腺病毒感染的293细胞诱导的二次感染只在注射局部产生，而对心、肝、肾等重要脏器无任何影响。小鼠体内实验结果显示，mfⅦ-SEA治疗组肺转移数（23±8）与空载体对照组（193±38）和PBS对照组（211±42）相比，差异有统计学意义（P〈0．01）。在抗小鼠前列腺肿瘤的动物实验中，mfⅦ-SEA对皮下肿瘤的抑制非常明显，第23天时，治疗组皮下肿瘤的体积平均为（342．6±107．1）mm^3，明显小于空载体对照组（2244．3±350）mm^3和SEA对照组（1208．3±210）mm^3。结论mfⅦ-SEA融合蛋白能明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长和肺转移的形成。

重组金黄色葡萄球菌肠毒素A协同增强破伤风类毒素的免疫原性研究

目的重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)与Al(OH)3佐剂联合应用协同增强破伤风类毒素(TT)的免疫原性观察。方法将高、低两个剂量的TT分别与高、中、低3个剂量的重组SEA同时吸附一定浓度的Al(OH)3作为样品组,同时设置高、低剂量TT分别与同样浓度Al(OH)3的吸附组作为对照;各组分别腹部皮下免疫NIH小鼠8只,0.5ml/只;免疫4周后,摘眼球采血,分离血清,检测各组抗TT抗体的IgG水平。结果在TT高剂量组,高、中剂量的SEA均能增强抗TT抗体的IgG水平(P<0.05),而低剂量SEA组与对照组相比未能增强TT的免疫原性;在TT低剂量组,3个剂量的SEA均能显著增强TT的免疫原性,P<0.05。结论 TT联合重组SEA及Al(OH)3佐剂能诱导免疫后小鼠产生更强的体液免疫应答,SEA及Al(OH)3佐剂对TT具有协同免疫增强效应。

金黄色葡萄球菌肠毒素A的原核表达及鉴定

[目的]高效制备金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)用于SEA快速检测相关产品的研究。[方法]通过原核表达的方法表达SEA,对其纯化方法进行研究,通过Western-blot和制备的SEA顺磁微粒免疫层析快速检测试纸条检测其免疫原性。[结果]SEA成功克隆入原核表达载体p ET22b(+),并在E.coil BL21(DE3)中得到有效表达,表达量达63.8%;采用低温诱导可获得可溶性的SEA,其表达量占总SEA的56.3%;可溶性SEA经Ni柱亲和层析一步纯化可得到纯度在95%左右的SEA,Western-blot检测显示所纯化的重组SEA具有SEA的免疫原性。[结论]研究构建的SEA表达载体能够高效、经济、简单的制备SEA,纯化的SEA可用于食物中毒中SEA快速检测相关产品的开发,具有一定的应用价值。

金黄色葡萄球菌肠毒素A抑制小鼠膀胱癌的实验研究

目的 :研究超抗原 (SAg)对膀胱肿瘤的抑癌效应。 方法 :采用已建立T739小鼠皮下可移植性膀胱肿瘤模型 60只 ,随机分为SEA组 ,BCG组和生理盐水组。观察治疗后各组的肿瘤重量和存活时间。结果 :SEA组小鼠肿瘤重量 ( 0 65± 0 .18g)明显低于生理盐水组 ( 4 2 8± 0 .86g) (P <0 0 1) ,抑瘤率为 84 7% ;小鼠存活期 ( 2 3 1± 2 .4 7d)比对照组 ( 18 6± 1.50d)延长 (P <0 0 1) ,存活延长率为 2 4 1% ;与BCG组比较 ,抑瘤率与存活延长率均无明显差异 (P >0 0 5)。结论 :超抗原做为一种新型高效的抗肿瘤生物制剂对膀胱癌有明显的抑癌效应。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达

目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b(+)构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果构建了表达载体pET42b(+)-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对异位皮炎患者外周血单个核细胞活化作用的观察

目的观察超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)对异位皮炎(AD)患者外周血单个核细胞(PBMC)的活化作用。方法用不同浓度的SEA刺激AD患者PBMC,MTT法观察PBMC增殖及流式细胞术检测T细胞表型情况。结果AD患者皮损表面金葡菌检出率为91.2%;当SEA为0.8μg/ml时PBMC表现了最大的增殖活性,健康志愿者SEA刺激后T细胞CD3、CD4、CD8表达显著降低,AD患者SEA刺激后T细胞CD3、CD4、CD8的表达显著增高,AD患者和健康志愿者SEA刺激前后CD4/CD8差异无显著性。结论AD患者皮损对金葡菌具有亲合性,SEA与AD发病有关。

荧光定量PCR检测牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立

为建立检测牛乳中金黄色葡萄球菌(S.aureus)肠毒素A基因(SEA)定性定量的检测方法,本研究针对S.aureus SEA基因片段设计1对引物,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了S.aureus SEA DNA的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,特异性产物Tm值为78.2℃～78.5℃,最低可检测到49.5 fg/μL(16.5拷贝)的阳性质粒。标准曲线的相关系数为0.99。与其他常见的产SEB的S.aureus、产SEC的S.aureus、无乳链球菌、大肠杆菌、嗜热链球菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌DH5α及JM109均无交叉反应。该检测方法具有较好的特异性和敏感性,为牛乳中S.aureus的快速检测提供了新的技术手段。

快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因方法的建立与应用

目的建立一种快速准确定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。方法以femB、SEA基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A的靶序列，设计合成引物和TaqMan探针；收集腹泻患者大便标本分离的金黄色葡萄球菌68株，并定量检测其肠毒素A。结果TaqMan探针荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球和肠毒素A的灵敏度均为1．0×10^2拷贝。68株金黄色葡萄球菌中检出产肠毒察A菌株11例（16．2％，11／68），CT值为13．5—20．6。结论TaqMan探针荧光聚合酶链反应能够准确快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A。

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3-5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。

金黄色葡萄球菌肠毒素A诱导的S180肉瘤细胞凋亡分析

分析了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导的S180肉瘤细胞凋亡。将S180肉瘤细胞接种于小鼠腋下,建立小鼠肿瘤模型,随机分为2组,即SEA实验组和生理盐水对照组,隔日进行腹腔注射,九天后解剖,将肿瘤组织做成石蜡切片。用末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法(TUNEL)检测S180肉瘤细胞凋亡,并用免疫组化方法观察CD8+T细胞和颗粒酶B的分布,最后用ELISA法检测血清、脾脏中TNF-α的含量。SEA组的凋亡指数明显大于对照组,SEA组肿瘤组织周围的CD8+T细胞、颗粒酶B明显多于对照组,且血清、脾脏中TNF-α的含量也高于对照组。SEA诱导S180细胞凋亡与颗粒酶B和TNF-α的分泌有关。

金黄色葡萄球菌肠毒素A对H22小鼠移植瘤的抑制作用

旨在探讨金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)在KM鼠体内的抑瘤效果。建立H22荷瘤小鼠模型,将20只小鼠随机分为对照组(生理盐水)、低剂量组(15μg/ml)、中剂量组(25μg/ml)和高剂量组(50μg/ml),观察肿瘤生长趋势,计算抑瘤率,通过ELISA检测IL-2的含量。结果显示,给药组肿瘤生长趋势均较对照组缓慢;对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的抑瘤率分别为0,28.9%,34.0%,51.0%(P<0.05);血清中IL-2含量分别为58.9pg/ml、83.6pg/ml、91.8pg/ml、118.1pg/ml。金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)可抑制H22肿瘤的生长,并上调IL-2的分泌。