冷胁迫下普通油茶CCCH型锌指蛋白基因家族的鉴定和分析

【目的】为挖掘和利用耐寒普通油茶Camellia oleifera遗传资源提供参考。【方法】基于普通油茶的冷胁迫转录组数据,对其CCCH型锌指蛋白基因进行鉴定,并对CCCH型锌指蛋白进行理化性质分析、系统发育分析、保守结构域预测、二级结构预测等相关生物信息学分析,并以庐山高海拔油茶(LSG)和栽培油茶品种赣无1(GW1)为材料,对CCCH型锌指蛋白基因在冷胁迫下的表达情况进行分析。【结果】在普通油茶的冷胁迫转录组数据中共鉴定到24个CCCH型锌指蛋白基因,参考水稻分类方法,将24个CCCH型锌指蛋白聚类到2个亚家族中。保守基序分析结果表明,在24个基因中仅有3种CCCH型锌指蛋白基序类型,即C-X8-C-X5-C-X3-H、C-X7-C-X5-C-X3-H和C-X5-C-X4-C-X3-H,数目分别为92、4和4。转录组表达谱分析结果表明:在野外冷胁迫试验中CoC3H17基因在D4、D5和D6时期的表达量高于D1、D2和D3时期,在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶和赣无1的CoC3H17基因一直表现为更高的转录本丰度;CoC3H14和CoC3H24基因在野外试验的D4、D5和D6时期均表现为表达量明显上升,且在室内冷胁迫试验中庐山高海拔油茶的这2个基因的表达量高于赣无1。【结论】CoC3H17、CoC3H14和CoC3H24基因可能是普通油茶应对冷胁迫的关键基因。

水稻种子发育期间特异锌指蛋白基因的筛选与分析

锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一.大部分的锌指模体存在于转录因子中,它们在转录水平上参与植物生长发育及植物对生物和非生物胁迫的反应.为了解锌指蛋白基因在水稻种子发育中的作用,本研究通过多种数据库搜索获得了878个水稻锌指蛋白基因.从中选取311个利用RT-PCR技术分析它们在水稻成熟期根、茎、叶、花及不同发育阶段种子中的表达特征.结果发现,共有196个基因能在至少1个水稻器官中表达,其中10个为种子特异性表达基因.进一步分析发现,10个特异表达基因在水稻种子不同发育阶段中的表达具有种子阶段表达特异性.同时分析它们的基因及蛋白结构特点,结果显示它们的结构较简单,其中3个蛋白含有线粒体靶肽,5个蛋白含有CCCH锌指结构域.另外,分析种子特异性表达基因上游调控区的顺式作用元件,结果表明它们都含有TATA-box、CAAT-box和种子特异调控元件,除此之外还发现了光、激素和胁迫反应相关调控元件.这些结果为进一步研究它们在种子发育过程中的生物学功能提供了有用的线索.

用RACE结合cDNA文库筛选的方法获取新的锌指蛋白基因

大多数有重要功能的蛋白质都含相应的由保守氨基酸顺序组成的功能结构域。本文首先根据蛋白质功能结构域保守氨基酸序列设计简并引物 ,用PCR方法扩增出基因EST序列 ,再利用改进的快速扩增cDNA末端(RACE)方法从cDNA文库中扩增出基因非同源部位 ,然后以非同源序列为探针 ,筛选cDNA文库。利用此方法成功地从人骨髓cDNA文库中克隆到几个编码锌指蛋白并代表原有EST的新的全长cDNA。这一策略也应适用于筛选编码具有其他序列保守性功能结构域蛋白的基因。

小鼠锌指蛋白基因ZF-12的克隆与基因结构以及5′端启动子活性的分析

人类锌指蛋白ZNF191为类kr櫣ｐｐｅｌ转录因子 ,其可能与神经精神病、心血管疾病和肝癌等疾病的发生或发展有关 ,为了采用基因敲除模型来探讨它的生理功能 ,克隆和定位其在模式生物 (小鼠 )中的同源基因 ,并阐明其结构特征是必需的。通过筛选小鼠λ噬菌体基因组文库 ,获得了它在小鼠中的同源基因ZF 12基因组全长片段。序列分析表明 :该基因含有 4个外显子和 3个内含子 ,内含子都遵循GT AG的剪接模式 ;第 91密码子处存在单核苷酸多态性 ;可能存在 2种大小不同的 3′端的非翻译区 (3′ UTR) ;与锌指蛋白基因Zfp 35相连锁 ,可将其定位于 18号染色体的B3 C带上或附近 ;5′端上游存在 1个约 2 5 0bp高度富含GC的启动子序列。ZF 12基因的 5′端系列缺失荧光素酶基因报告载体的瞬时转染实验表明 :其上游序列 (- 76 2～ +70bp)具有启动子转录活性 ,在更上游的序列(- 82 4～ - 76 2bp)上可能存在负调控元件。这项研究结果为进一步的基因敲除研究奠定了基础。

火龙果类锌指蛋白基因片段的克隆及表达分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录的调控中发挥着重要作用.根据火龙果抗逆cDNA芯片中的一个EST设计一对引物,采用RT-PCR克隆火龙果类锌指蛋白基因片段,生物信息学分析表明,该片段长334bp,编码1中含有109个氨基酸残基的肽链,命名为HuZF.该基因序列与其它植物锌指蛋白基因核苷酸序列的同源性均在70%以上,推测的氨基酸序列与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列的同源性达60%以上.RT-PCR分析表明,高盐和干旱胁迫下,火龙果茎中HuZF的表达增强,低温胁迫时,HuZF的表达先减弱后增强,初步推测该基因的表达与火龙果低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关.

一个与小鼠锌指蛋白基因ZF-12相关的假基因的克隆和鉴定

小鼠类Krüppel锌指蛋白基因ZF-12为人的类Krüppel锌指蛋白基因ZNF191的同源基因,它们都编码368个氨基酸残基,N端存在SCAN结构域,C端有4个连续的锌指模体,最近的研究表明ZNF191是肝癌发生的相关基因。我们以人锌指蛋白基因ZNF191的cDNA为探针,筛选小鼠λ噬菌体基因组文库,意外地获得了1个与小鼠锌指蛋白基因ZF-12相类似的基因,多种组织的RT-PCR和启动子序列分析,暗示该基因不表达,且该基因无内含子,与ZF-12高度相似,存在突变,暗示其为与ZF-12相关的假基因序列,经查新证实它为新的序列后,以ZF12p(ZF-12 pseudogene)命名在GenBank登录(AY040222)。查寻GenBank的人类基因组库以及Southern结果显示人类基因组中无ZNF191假基因序列。ZF12p与ZF-12高度相似,暗示ZF12p在进化过程中产生的时间较晚,这对研究锌指蛋白基因ZF-12的突变与进化具有重要的意义。

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF 12基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠ZF 12基因座的替换型打靶载体pSSC TV 10 .5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后 ,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES细胞内 ,经G4 18/GANC双药筛选和分子鉴定 ,获得 4个ZF 12 + /-基因的ES细胞杂合子克隆 ,其生长状态良好 ,为进一步建立ZF 12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。

小麦锌指蛋白基因TaZAT6的克隆、特征分析及其在不同磷水平下的表达

【目的】在克隆小麦锌指蛋白基因TaZAT6的基础上,深入研究该基因的分子特征和在不同磷水平下的表达特性。【方法】通过对富集石新828不同低磷胁迫时间点特异表达基因的cDNA差减文库克隆测序,获得1锌指蛋白型转录因子基因EST。利用RT-PCR技术,在低磷处理24h的石新828和冀7369根系中克隆了该锌指蛋白基因TaZAT6,并采用该技术进一步研究该基因应答介质中Pi的特征。【结果】TaZAT6开放阅读框为717bp,编码238个氨基酸残基,编码的蛋白质中含有1个保守的核定位区、2个C2H2锌指蛋白域和1个DLN保守盒。系统进化分析表明,TaZAT6可能与另外2个小麦锌指蛋白基因ZAT22和ZAT23具有共同的祖先。TaZAT6的表达表现为明显的低磷诱导特性,恢复至正常磷水平下其表达降低至磷胁迫前水平。与磷低效品种冀7369相比,石新828根叶中TaZAT6具有更强应答低磷胁迫能力。小麦高亲和磷转运蛋白基因TaPT2对生长介质中Pi的响应特点与TaZAT6相似,表明TaZAT6可能参与了对TaPT2的转录调节。【结论】低磷胁迫条件下,石新828中TaZAT6具有较强应答Pi能力,由此进一步调控下游基因表达,可能与该品种在低磷下表现磷高效具有密切联系。

金黄壳囊孢菌侵染过程中银中杨锌指蛋白基因的表达

研究了银中杨接种金黄壳囊孢菌后锌指蛋白基因的表达,为林木抗病遗传育种工作奠定基础。从杨树上分离得到了一株杨树烂皮病菌(CHH001),测定其对银中杨的致病力,并采用形态学和ITS-PCR鉴定方法鉴定该菌株为金黄壳囊孢菌。采用实时定量荧光PCR技术对银中杨接种金黄壳囊孢菌后锌指蛋白基因的表达进行了研究。实验结果显示,ZFP1和69-Ⅳ-2-4在接种后表达水平持续上升,ZFP1在48 h的基因表达量分别为烫伤对照和空白对照的4.21倍和3.11倍;69-Ⅳ-2-4在48 h为烫伤对照和空白对照的9.56和7.06倍。ZFP1和69-Ⅳ-2-4在接种前期高表达,表明可能参与了植物与病原物的识别过程和防御反应。

在人类胚胎发育过程中表达的新锌指蛋白基因ZNF359的研究

kr櫣ｐｐｌｅ型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子 .初步克隆了一个新的人类kr櫣ｐｐｌｅ型锌指蛋白基因 ,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF35 9.此基因长 32 71个碱基 ,含 6个外显子 ,在基因组DNA上长1 8kb .它编码的蛋白质全长 6 4 3个氨基酸 ,含一个KRAB框 ,1 6个C2H2型的锌指 ,在两者之间还有一个典型的中间重复序列 .NorthernBolt分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达 ,且在肾、心脏和肺的表达水平最强 .

小白菜RING锌指蛋白基因的克隆及其表达分析

锌指蛋白在调控植物防御和抗性方面具有重要作用。根据从小白菜中获得的与铜胁迫相关的RING锌指蛋白基因TDF片段设计引物,应用RACE技术克隆出具有完整阅读框的小白菜RING锌指蛋白基因,该基因全长855 bp,开放阅读框606 bp,编码202个氨基酸,分子量为21.32 ku,理论等电点为6.87,属于中性蛋白。结构分析结果表明,该蛋白C-端含有1个保守的C3HC4型RING锌指结构域。进化树分析结果显示,小白菜RING锌指蛋白与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%,属于C3HC4型RING锌指亚家族。RT-PCR分析结果表明,在铜胁迫下该基因下调表达,推测其可能参与对铜胁迫的应答反应。此结果为进一步研究该基因在小白菜逆境应答中的作用机制奠定基础。

一个新的家蚕锌指蛋白基因的克隆及基因组结构分析

锌指蛋白是一类能与细胞内核酸特异结合 ,调控基因表达活性 ,对细胞分裂、分化、胚胎发育及个体生长有重要作用的转录因子。从家蚕 5龄丝腺组织cDNA文库中克隆了一个具有锌指结构的新基因 ,命名为BmZFP基因 (GenBank登录号 :AY75 36 5 9) ,其cDNA全长为 180 9bp ,编码 14 3个氨基酸 ,3′端非翻译区 (3′ untranslatedregion ;3′ UTR)达 1332bp碱基序列。BmZFP氨基酸序列推测有 6个功能结构域 ,是一种CCHC型锌指蛋白。虽然BmZFP氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白的氨基酸序列同源性只有 33%左右 ,但 6个功能域中的Cys(C)和His(H)却完全匹配 ,推测其功能与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白有相似性。BmZFP基因序列的结构分析表明 :该基因由 2个外显子和 1个 14 86bp碱基序列的内含子组成 ,在 5′端上游 - 182～ - 2 2 2区域存在一个启动子元件 ,但不是典型的TATA盒启动子。

斜纹夜蛾核多角体病毒DNA XbaI 4.0 kb片段锌指蛋白基因及重复序列分析

测定了斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中山大学分离株基因组DNAXbaI4.0kb片段全序列 ,该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列 (SR1、SR2、SR3)。该锌指蛋白基因读码框为 2 196个核苷酸 ,编码 731个氨基酸的蛋白质 ,分子量为 83 .0 9kD ,该蛋白的等电点为 4.6 1。在其 5′非编码区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT及一个TATA盒 ,在其终止密码的下游有 5个真核生物转录mRNA时poly(A)加尾信号AATAAA。在 2 2 3～ 2 41氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序 ,这一基序属于锌指蛋白基序中的C3HC4类 ,即环指 (Ringfinger)类基序。在 32 3～ 340氨基酸残基区域为一个核定位信号。该蛋白可能为一个高度折叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域 (SR1、SR2、SR3) ,其中SR1与SR3区域存在更大量的重复序列 ,SR1区域其中的一个重复序列长达 41bp ,SR1、SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子 ,或者作为DNA复制的起始点。

人C2H2型锌指蛋白基因ZNF194全长cDNA的克隆

用一个含有锌指编码序列的人cDNA片段(L2～9)作为探针杂交筛选人肝组织cDNA分子库,得到8个杂交阳性克隆,经测序和拼接后,将其整合为一条长1838bp的cDNA序列.该序列的221～1642bp为一个完整的开放阅读框,编码了一个由473个氨基酸组成的蛋白质,1～220 bp为5’-UTR,1643～1838 bp为3’-UTR,在1801～1806bp有一个加尾信号序列AATAAA,3’端为18 bp的polyA.编码蛋白质已被HGMW命名为ZNF194.全长cDNA在GenBank登录为No.U95044.ZNF194蛋白的N端有一个KRAB-A box,C端含10个C_2H_2型锌指结构.该基因呈泛在性表达,经用FISH方法定位,结果显示它位于染色体19q13.3～13.

水稻C2C2锌指蛋白基因OsLSD2对日本晴品种生长及氮素利用的影响

LSD1基因家族是一类特殊的C2C2型锌指蛋白基因。OsLSD2是LSD1型基因家族的一员。已知LSD1基因参与了植物抗病信号途径。为了培育环境友好型水稻,我们研究了OsLSD2在日本晴中的过量表达。T3代转基因水稻表型表现为株高降低,分蘖数平均减少2个,结实率只有64%～72%,单株产量下降33%～42%,生育期提前15d,对氮素的吸收利用率降低等,说明该基因过量表达显著抑制水稻的生长和氮素转运。

甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因鉴别和表达模式

植物TFⅢA型锌指蛋白的锌指区含有保守的QALGGH区,属于C2H2型转录因子,参与调控植物生长发育和逆境胁迫应答.参照拟南芥AtZFP基因的C2H2结构域氨基酸序列,采用生物信息学方法鉴定了46个甘蓝型油菜TFⅢA型锌指蛋白基因,分析了基因结构、生化特性、进化关系和基因表达模式.结果表明：42个基因为单锌指蛋白基因,4个为多锌指蛋白基因;40个基因不含内含子,6个基因含内含子;46个基因的氨基酸序列同源性变幅为9.0% ～99.2%,氨基酸序列保守性差异明显,亚类成员间包含相同的保守基序,亚类间的保守基序不同;PlantCARE分析发现其启动子区富含激素、非生物胁迫及特定生理过程响应的顺式作用元件;RNA-seq分析表明,部分基因在甘蓝型油菜品种中双11号的根、初花期雌蕊和角果中特异表达.

端粒相关锌指蛋白基因TASL30在人早期胚胎与组织中的mRNA表达及染色体定位

采用原位杂交和RNA点杂交方法 ,观察了一种新的端粒相关锌指基因TASL30在早期人胚与50种器官组织中的mRNA表达。结果表明 ,TASL30基因在早期人胚神经管中有明显表达 ,其中在神经管的头端表达最强 ,而在人的50种器官组织中均未检测到该基因的明显表达。另外通过G -显带和染色体原位杂交 ,将TASL30基因定位于人染色体12q24～qter。

核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】Q型C2H2锌指蛋白在植物抵抗非生物胁迫中起重要作用。为深入了解核桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族在核桃全基因组中的特征,对核桃Q型C2H2锌指蛋白(JrZFP)基因家族进行全基因组鉴定与分析,并研究其在核桃干旱和盐胁迫应答过程中的表达模式。【方法】利用生物信息学方法鉴定了核桃全基因组中的Q型C2H2锌指蛋白基因家族成员,并对其理化性质、染色体定位、进化关系和基因结构进行分析;根据JrZFP基因家族进化树随机挑选15个JrZFP基因,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)方法检测15个基因在干旱和盐胁迫下的响应特性。【结果】在核桃中共鉴定出82个Q型C2H2锌指蛋白基因,其蛋白质序列长度介于59~636个氨基酸之间,亚细胞定位主要位于细胞核中;该基因家族成员不均匀分布在15条染色体上,其中有11对JrZFPs基因为串联重复基因,63个JrZFP基因参与片段重复事件;基因结构分析表明,75个JrZFP基因无内含子,其余成员含有1~10个外显子;上游启动子区分析发现,该基因家族成员含有参与逆境胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。表达分析结果显示,在盐胁迫下15个JrZFP基因均显著上调,以JrZFP55最为明显,推测JrZFP55在核桃NaCl胁迫中起正向调节作用;在干旱胁迫下15个JrZFP基因中上调6个,其中JrZFP12上调最为显著,下调9个,以JrZFP4、JrZFP55和JrZFP57下调程度最大,推测这3个基因在核桃干旱胁迫中起负调控作用。【结论】核桃全基因组中有82个JrZFP家族成员都具有Q型C2H2锌指蛋白典型结构域,且通过qRT-PCR对随机挑选基因进行分析以发现可能参与干旱和盐胁迫的JrZFPs基因,为深入研究核桃JrZFP参与干旱胁迫和盐胁迫提供理论依据。

绿竹锌指蛋白基因BoBZF克隆及功能初步分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录调控中发挥着重要作用。采用RT-PCR和RACE技术,从绿竹叶片中分离到1个锌指蛋白基因,命名为BoBZF(GenBank登记号:EU606025)。BoBZF cDNA全长1076bp,编码256个氨基酸。蛋白结构分析表明,其编码的蛋白具有2个B-Box结构域,属于B-Box型锌指蛋白。组织特异性表达显示BoBZF在叶片、叶鞘、幼茎和根中均有表达,其中在叶片的表达丰度较高。将BoBZF置于CaMV35S启动子控制下,构建到载体pBI121的多克隆位点,并转化拟南芥。RT-PCR分析表明,BoBZF已在拟南芥中表达。转基因植株耐旱性明显提高,意味着BoBZF与竹子的耐旱能力有关。