曼耗群钩端螺旋体的一个新血清型——贺岩型

目的 对从患者分离的L231钩端螺旋体菌株进行分类检定,明确其型别。方法 采用经典的血清学分类检定法和脉冲场凝胶电泳分析法。结果 证明该菌株应归属我国独有的曼耗群钩端螺旋体,且与该群原有的5个血清型参考菌株均不相同,为一个新的血清型,命名为贺岩型,其代表菌株为L231株。

钩端螺旋体外膜蛋白Loa22免疫血清与不同血清型钩端螺旋体的交叉免疫反应

目的探讨钩端螺旋体(钩体)外膜蛋白Loa22免疫血清与不同血清型钩体间的交叉免疫反应作用,为筛选钩体候选疫苗分子提供依据。方法制备钩体重组Loa22蛋白、LipL32蛋白豚鼠免疫血清,以LipL32免疫血清为阳性对照,未免疫豚鼠为阴性对照,ELISA测定与我国常见的各血清型钩体株的交叉反应的Loa22蛋白免疫血清效价。结果与钩体犬群犬型56603株、致热群致热型56605株、澳洲群澳洲型56607株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临海型56609株、七日群七日热型56610株及明尼群明尼型56655株反应的钩体Loa22蛋白免疫血清效价分别为1∶81 920、1∶20 480、1∶40 960、1∶40 960、1∶40 960、1∶10 240和1∶10 240。结论Loa22蛋白免疫血清与不同血清型钩体有良好的交叉免疫反应性。

不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究

目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况,采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清,免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A.1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果:我国13株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体三宝垄群patoc型Patoc株则否。与报道的序列(GenBank accession No.:NP_712236)比较,所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.02%～100%和97.91%～100%。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量为细菌总蛋白的5%。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,且其转录水平呈细胞接触上调模式,表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。

问号钩端螺旋体检测基因芯片的研制

目的 制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法 从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片上制备成基因芯片。用Cy3标记引物 ,通过不对称PCR反应获取荧光素标记的靶序列 ,然后与制备的芯片杂交。结果 设计的引物与探针仅同时与问号钩体 2 3srDNA完全同源。该引物可扩增我国 18个血清群的 2 5株钩体 ,均出现单一 4 82bp的扩增产物 ,而双曲钩体及其他螺旋体、病原、空白对照均无任何DNA扩增条带。芯片杂交结果与常规PCR方法结果一致 ,敏感性高于PCR。结论 基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测问号钩端螺旋体。

问号钩端螺旋体属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答

为了确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性OmpL1s抗原膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型,为OmpL1s用于研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒抗原提供依据。采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区156份钩体病人血清标本。用PCR和核苷酸序列分析,了解中国流行的钩体主要血清群ompL1基因型。采用常规基因工程技术构建ompL1/1和ompL1/2主要基因型原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rOmpL1/1和rOmpL1/2。采用胶体金免疫电镜技术,对OmpL1s进行膜定位。建立了基于rOmpL1s的ELISAs,检测钩体病人血清中特异性抗体水平及其类型。试验结果表明,黄疸出血群钩体仍然是四川地区最主要的优势钩体血清群。中国流行的钩体主要血清群ompL1基因可有ompL1/1和ompL1/2两个基因型,两者核苷酸和氨基酸序列相似性之间有较明显的差异。OmpL1s是位于钩体外膜表面的蛋白分子。不同稀释度的156例钩体病人血清标本中,rOmpL1/1和rOmpL1/2特异性IgM阳性率分别为67.9%～79.5%和75.0%～75.6%,特异性IgG阳性率分别为71.8%～79.5%和75.0%～76.9%。上述试验结果提示,OmpL1s是位于钩体表面属特异性蛋白抗原。自然感染钩体时,rOmpL1/1和rOmpL1/2均可诱导机体体液免疫应答并产生IgM和IgG两类血清抗体,且两者之间有广泛的抗原交叉反应。rOmpL1/1和rOmpL1/2可作为研制通用性钩体基因工程疫苗和检测试剂盒的候选抗原。

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL41/1融合基因原核表达系统的构建及其应用

目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 ) lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因及其原核表达系统 ,了解钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因携带和表达情况及钩体患者的血清抗体水平。方法 :采用连接引物 PCR构建 lip L32 / 1- li-p L4 1/ 1融合基因 ,常规方法构建其原核表达系统。采用 SDS- PAGE检测目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1表达情况。采用 Western blot鉴定 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1的免疫原性。采用 PCR和 MAT分别检测 97株问号钩体野生株 lip L32和 lip L4 1基因及其表达情况。采用 EL ISA检测 2 2 8例钩体患者血清 lip L32和 lip L4 1基因产物的抗体。结果 :与报道的相关序列比较 ,lip L 32 / 1- lip L 4 1/ 1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为 99.9%和99.8%。目的重组蛋白 r Lip L32 / 1- r Lip L4 1/ 1表达产量约为细菌总蛋白的 10 % ,主要以包涵体形式存在。r L ip L32 /1和 r Lip L4 1/ 1兔抗血清均能与 r L ip L32 / 1- r L ip L4 1/ 1结合。 97.9%和 87.6 %问号钩体野生株分别有 lip L32和 li-p L4 1基因。95 .9%和 84 .5 %问号钩体野生株分别与 r Lip L32 s和 r Lip L4 1s兔抗血清出现效价 ,为 1∶ 4～ 1∶ 12 8的MAT阳性结果。分别有 94 .7%～ 97.4 %和 78.

问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。

问号钩端螺旋体lipL21基因改建及其表达产物免疫原性变化和定位

目的：改建问号钩端螺旋体（简称钩体）lipL21基因核苷酸序列以提高表达产量并了解基因改建前后表达产物免疫原性变化，确定外膜脂蛋白LipL21在钩体表面的定位。方法：参照大肠杆菌偏爱密码子设计，合成lipL21基因核苷酸序列并构建其原核表达系统。采用SDS—PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测改建前后lipL21基因表达量变化。采用钩体TR／PatocI抗血清为一抗的Westernblot鉴定改建前后两种目的重组蛋白rLipL2ls的免疫反应性，显微镜凝集试验（MAT）比较改建前后rLipL21s抗血清对不同钩体血清群的交叉免疫凝集效价变化。应用免疫电镜技术对LipL21进行定位。结果：改建前后lipL21基因表达量分别为细菌总蛋白的8．5％和46．5％。两种rLipL21均能与TR／PatocI抗血清发生免疫结合反应，免疫家兔后均能产生特异性抗体。两种rLipL21兔抗血清对我国15群15型钩体参考标准株MAT效价相近，均为1：80～1：320。LipL21位于钩体外膜表面。结论：LipL21是钩体表面抗原。改建后的lipL21基因可明显提高原核表达产量，其产物可保持良好的抗原性和免疫反应性，其抗体具有广泛的交叉免疫凝集活性。

湖南省2007年钩端螺旋体病血清学监测分析

目的了解湖南省钩端螺旋体病流行的主要血清群(型)及其分布,为防治提供科学依据。方法在6个监测点采集健康人群血清,MAT法检测抗体,采用SPSS13.0分析。结果人群钩体抗体总阳性率为61.04%,男、女性阳性率分别为62.27%和60.06%(P>0.05)。10～19、20～29、30～39、40～49和50～岁年龄组抗体阳性率分别为43.01%、57.78%、60.76%、67.59%和69.23%(P<0.05)。宁乡县、湘潭县、双峰县、沅江市、浏阳市、醴陵市抗体阳性率分别为52.53%、62.50%、55.00%、73.79%、70.00%和51.00%(P<0.05)。赖、拜伦、澳洲、秋季、临海、七日热、犬、清水、波摩那、乌尔夫型抗体阳性率分别为30.19%、27.27%、23.70%、12.50%、8.77%、6.17%、5.36%、4.38%、3.41%和1.30%(P<0.05)。结论湖南省以黄疸出血群赖型、秋季群秋季型、拜伦群拜伦型、澳洲群澳洲型为主要血清型,抗体阳性率在地区、年龄、均存在差异。

2006年湖南省钩端螺旋体病血清流行病学调查研究

目的了解湖南省钩端螺旋体病流行的主要血清群(型)及其分布,为防治提供科学依据。方法在7个监测点采集健康人群血清,显微凝集试验(MAT)法检测抗体,采用SPSS13.0分析。结果人群钩体抗体总阳性率为60.41%,男、女性阳性率分别为 65.48%、56.63%(P<0.05)。10～、20～、30～、40～和50～岁年龄组抗体阳性率分别为34.26%、60.00%、67.57%、70.27%和 62.43%( P<0.05)。浏阳市、沅江市、邵东县、双峰县、宁乡县、株洲县和湘潭县抗体总阳性率分别为81.00%、71.96%、69.31%、68.00%、58.59%、39.39%和37.82%( P<0.05)。赖、临海、秋季、澳洲、拜伦、犬型、波摩那、清水、七日热和乌尔夫型抗体阳性率分别为35.86%、27.45%、19.03%、16.97%、15.17%、11.31%、8.97%、6.07%、4.69%和1.93%(P<0.05)。结论湖南省以赖型、秋季型、临海型为主要血清型,抗体阳性率在地区、年龄、性别间均存在差异。

问号钩端螺旋体诱导的Vero和J774A.1细胞的凋亡和超微结构病变

目的 :探讨不同毒力的钩体黏附和侵入宿主细胞能力及其病理变化。方法 :建立 Fontana镀银染色法用于观察问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株、波摩那群波摩那型 5 6 6 0 8株和双曲钩体三堡隆群 patoc型 Patoc 株黏附 Vero和 J774 A.1细胞的能力 ;采用电镜技术观察感染细胞的超微结构病变 ;采用 FITC- Annexin V/PI荧光标记流式细胞术 ,检测紫外线灭活前后的上述钩体菌株诱导 Vero和 J774 A.1细胞凋亡或坏死的情况。结果 :问号钩体 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株对 Vero细胞的黏附率分别为 2 4 .2 %和 2 2 .9% (P>0 .0 5 ) ;对 J774 A.1细胞的黏附率分别为4 9.0 %和 4 6 .9% (P>0 .0 5 ) ;双曲钩体 Patoc 株不能黏附细胞。两株问号钩体侵入细胞后形成含有钩体的特殊吞噬泡 ,并引起相似的细胞超微结构病变 ,如细胞核染色质浓缩或溶解、细胞空泡变性、线粒体肿胀及线粒体嵴消失、内质网肿胀和膜旁核糖体消失等。灭活前的 5 6 6 0 1和 5 6 6 0 8株引起的 Vero细胞凋亡率分别为 84 .4 %和 82 .8% ,灭活后则分别为 77.9%和 86 .1%。灭活前后的 5 6 6 0 1株均以诱导 Vero细胞晚期凋亡为主 ,其凋亡率分别 6 8.0 %和5 2 .9%。灭活前后的 5 6 6 0 8株均以诱导 Vero细胞早期凋亡为主 ,其凋亡率分别为 6 4.1%和 5 0 .1%

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。

问号钩端螺旋体主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究

目的 :了解问号钩端螺旋体 (简称钩体 )主要外膜蛋白 Omp L 1、Lip L 32和 L ip L 4 1免疫功能表位及其致炎作用。方法 :建立 Ni- NTA亲和层析法 ,提取不同基因型表达的目的重组蛋白 r Omp L1/ 1和 Omp L1/ 2、L ip L32 / 1和 r Lip L32 / 2、Lip L4 1/ 1和 r Lip L4 1/ 2。采用 SDS- PAGE检测上述目的重组蛋白的表达情况和提取物纯度。分别采用 Signal P3.0预测服务器 Signal P- NN软件、Propred MHC class- binding peptide prediction- Pro Pred预测服务器 EMBOSS软件 ,对上述蛋白的信号肽、MHC- 类分子结合肽和 B细胞表位进行分析。以人脐静脉内皮细胞株EVC- 30 4为效应细胞 ,采用 EL ISA检测上述目的重组蛋白诱导人脐静脉内皮细胞 EVC- 30 4分泌 IL - 1、IL - 8和TNF- α的作用。结果 :在 IPTG诱导下 ,所构建的原核表达系统可有效表达 r Omp L1/ 1和 r Omp L1/ 2、r Lip L32 / 1和r Lip L32 / 2、r L ip L4 1/ 1和 r Lip L4 1/ 2 ,其产量分别约占细菌总蛋白的 30 %和 15 %、4 0 %和 35 %、15 %和 10 %。提纯后的目的重组蛋白 SDS- PAGE后均仅见单一的蛋白条带。Omp L1s、Lip L32 / 1和 Lip L32 / 2、Lip L4 1s的信号肽分别位于 N端 1- 2 4、1- 2 1和 1- 2 4、1- 2 4位氨基酸残基。 Omp L 1s。

问号钩端螺旋体磷脂酶C的活性及其内化时细胞内游离Ca^(2+)水平的变化

目的 :了解不同毒力的钩端螺旋体 (简称钩体 )对细胞内游离 Ca2 + 水平的影响及其磷脂酶 C(PL C)活性与细胞内游离 Ca2 + 水平的关系。方法 :建立问号钩体 Vero和 J774 A.1细胞感染模型。采用 fluo- 3/ AM胞内 Ca2 +特异荧光标记激光共聚焦技术 ,检测强毒力的问号钩体黄疸出血群赖型 5 6 6 0 1株和弱毒力的波摩那群波摩那型5 6 6 0 8株及无毒力的双曲钩体 Patoc 株作用的 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离 Ca2 +水平。以 [3 H]PIP2 为底物 ,采用同位素法检测上述 3株钩体培养物上清、胞浆和胞膜中 PLC的活性。结果 :正常 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离Ca2 + 基础值分别为 (10 2 .3± 8.2 ) %和 (10 5 .9± 7.3) % ,在观察时间内 Patoc 株钩体作用细胞的荧光强度变化百分数一直波动于 (10 2 .3± 8.2 ) %～ (10 2 .2± 8.3) %。问号钩体 5 6 6 0 1株感染的 Vero和 J774 A.1细胞胞内游离Ca2 +浓度呈双峰型增高 ,第一峰荧光强度变化百分数分别为 (430 .5± 35 .7) %和 (74 7.5± 18.5 ) % ,第二峰荧光强度变化百分数分别为 (380 .6± 17.4 ) %和 (80 4 .6± 2 2 .4 ) %。问号钩体 5 6 6 0 8株感染 Vero和 J774 A.1细胞 ,其胞内游离 Ca2 +浓度均呈缓慢的单一坡型升高 ,其最大荧光强度变化百分数分别为 (2 35 .

8省区176株钩端螺旋体菌株血清学分类检定

为全国钩端螺旋体（钩体）病地理流行病学调查，对福建、浙江、安徽、湖南、湖北、贵州、云南和四川８省区新近分离的钩体菌株采用凝集试验和因子血清分型方法进行了血清学分类检定。结果证明，这些菌株分属于问号状钩体和双曲钩体１４个血清群２０个血清型，并发现６个地方新型钩体，有安徽的秋季型和棉兰型，贵州的爪哇型和棉兰型、福建的派托型，江淮型和皖水型。

问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。

问号钩端螺旋体属lipL32/1-ompL1/1融合基因的真核表达及其表达产物的免疫反应性

目的 :构建问号钩端螺旋体 (简称钩体 )的融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1真核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性。方法 :采用连接引物 PCR构建融合基因 lip L32 / 1- omp L1/ 1,克隆测序后构建 lip L32 / 1- omp L1/ 1的毕赤酵母真核表达系统 p PIC9K- lip L32 / 1- omp L1/ 1- P.pastoris GS115。用 MM和 MD平板分离 His+ Mut+型菌落 ,YPD平板筛选出 G4 18高抗性的 His+ Mut+ 转化子。以酵母裂解酶处理的高拷贝转化子 His+ Mut+ 克隆裂解产物为模板 ,5 'AOX1和 3'AOX1为引物 ,用 PCR检测所构建的毕赤酵母工程菌株染色体 DNA中的目的融合基因。在 BMMY培养基中用甲醇诱导目的重组蛋白 r L ip L32 / 1- r Omp L1/ 1表达。采用硫酸铵沉淀 ,Ni- NTA亲和层析提纯培养物上清液中的 r L ip L 32 / 1- r Omp L1/ 1。采用 SDS- PAGE和 Western blot分别检测 r L ip L 32 / 1- r Omp L 1/ 1的产量及其免疫反应性。结果 :获得的 lip L32 / 1- omp L1/ 1融合基因约为 1794 bp。其核苷酸和氨基酸序列与原始lip L32 / 1和 omp L1/ 1基因型比较 ,相似性分别高达 99.94 %和 10 0 %。所构建的真核表达系统可分泌 r Lip L32 / 1-r Omp L1/ 1,SDS- PAGE后位于预期位置处 ,产量约占上清总蛋白的 4 0 %。r Lip L32 /

问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。