鸡产蛋下降综合征病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用

为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明,检测接种EDSV的96孔细胞培养板时,多抗血清的最适工作浓度为1∶320,孵育时间为45 min;FITC标记的兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶200,孵育时间为30 min;病毒敏感性试验表明,该方法可以检测到10-2 TCID 50/mL的病毒;多抗血清敏感度试验表明,当多抗血清稀释到1∶1280时仍可见较明显的特异性荧光;特异性试验表明,该方法只针对EDSV,而不与禽副流感病毒4型、鸡新城疫病毒等其他病原反应;批内重复性试验和批间重复性试验结果表明,该方法具有较好的重复性和可靠性。结果表明,建立的间接免疫荧光方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性,可为我国禽源性生物材料EDSV的检测提供技术支持,有巨大的市场需求。

鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

为建立鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒(MDV HVT)的间接免疫荧光方法,将MDV HVT病毒接种96孔细胞板培养(CEF),72 h后用鸡抗马立克氏病病毒阳性血清作为一抗和兔抗鸡荧光抗体作为二抗,对反应条件进行优化,建立了间接免疫荧光方法(IFA)。并与经典的马立克蚀斑计数方法进行病毒滴度的测定比较,运用统计学方法分析,P小于0.05,相关系数为0.995,说明两种方法相关性很好,两种方法均可用于马立克氏病病毒的滴度测定。IFA方法较蚀斑计数方法操作简便快捷,可代替蚀斑计数方法用于马立克氏病活疫苗的病毒含量的初步测定,同时为2025年版《中国兽药典》马立克氏病活疫苗增加IFA鉴别检验方法积累实验数据。

弓形虫GRA1蛋白单克隆抗体的制备与间接免疫荧光检测方法的建立

本研究旨在利用原核表达系统表达弓形虫GRA1蛋白并制备单克隆抗体,用于弓形虫病的诊断及GRA1蛋白功能研究。以弓形虫cDNA为模板,设计引物扩增GRA1基因片段,构建原核表达质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG诱导表达蛋白并纯化。用纯化后的重组蛋白作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定。以制备的弓形虫GRA1单克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,优化反应条件建立弓形虫间接免疫荧光检测方法。结果表明:成功构建了原核表达质粒pET-30a(+)-TG-GRA1;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白GRA1为可溶性表达,分子量约为27 kDa;Western blot结果显示重组蛋白GRA1可被犬弓形虫阳性血清识别,表明GRA1有良好的反应原性。成功筛选出5株单克隆细胞株,分别命名为1-B10、2-C3、2-C9、3-C11以及6-E6,并对它们进行亚型鉴定,其中2-C3、2-C9、3-C11为IgG1,1-B10、6-E6为IgM;IFA结果显示单克隆抗体具有良好的反应原性;建立了mAb 2-C9最佳稀释浓度为0.875μg/mL、最佳孵育时间为1.5 h,FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数为1∶400、最佳孵育时间为1.5 h的间接免疫荧光检测方法,并对15只小鼠的肝脏组织切片进行检测,结果表明该方法可用于弓形虫动物组织切片的检测,有助于弓形虫感染的实验室诊断及弓形虫的动态分布研究。

直接免疫荧光法和间接免疫荧光法检测患儿下呼吸道感染病原体方法的比较

目的比较在下呼吸道感染患儿病原体检测中,直接免疫荧光法(DFA)和间接免疫荧光法(IFA)的检测结果及影响因素。方法选取2022年1—5月该院住院部下呼吸道感染患儿103例为研究对象,分别采集两份鼻咽拭子和2 mL静脉血,用DFA检测病毒抗原和IFA检测血清中病原体IgM抗体,同时用荧光PCR法进行复检。比较两种方法的灵敏度、特异度及一致性,分析患儿年龄、性别、发病天数、是否用药对检测结果的影响。结果DFA和IFA两种方法检测的灵敏度分别为60.71%和12.50%,特异度分别为100.00%和48.94%,差异有统计学意义(P<0.001)。流感病毒(IFV)B、腺病毒(ADV)两种方法的检测结果具有一致性,但一致性程度差;IFVA、呼吸道合胞病毒(RSV)及副流感病毒(PIV)两种方法的检测结果不具有一致性。患儿发病天数、性别、是否用药的检测阳性率经比较,差异无统计学意义(P>0.05)。≤1岁和2~3岁患儿的检测阳性率均高于4~5岁、6~7岁和≥8岁患儿,RSV和ADV为主要病原体,且各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在下呼吸道感染患儿中,3岁以下的儿童呼吸道病毒感染率最高,以RSV和ADV为主。DFA和IFA检测结果差异显著,DFA的检测灵敏度和特异度均高于IFA。因此DFA更利于明确患儿下呼吸道感染病原体种类。

免疫胶体金法与间接免疫荧光法检测对下呼吸道感染患儿肺炎支原体感染的诊断价值分析

目的评价免疫胶体金法(immune colloidal gold technique,GICT)与间接免疫荧光法(indirect immunofluores⁃cence assay,IFA)对下呼吸道感染患儿肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)感染诊断的临床价值。方法收集2019年在海军第九七一医院利用GICT与IFA行MP⁃IgM抗体检测的134例下呼吸道感染患儿的临床资料,比较2种检测方法对MP感染的阳性率、临床符合率,以及2种检测方法分别在不同年龄组、不同病程组之间的差异。结果GICT的MP检测阳性例数为62例(46.3%),IFA的MP检测阳性例数为99例(73.9%),2种方法比较差异有统计学意义(P<0.01)。GICT对MP感染的临床符合率为54.5%,IFA的临床符合率为80.6%,差异有统计学意义(P<0.01)。2种检测方法分别在不同年龄组对MP感染阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。按照在不同病程分组,4~7 d组和>7 d组GICT对MP检测阳性率分别为34.2%、58.6%,差异有统计学意义(P=0.005);4~7 d组和>7 d组IFA对MP检测阳性率分别为65.8%、84.5%,差异有统计学意义(P=0.015)。在>7 d组的58例中,2种检测方法均阳性有30例,该30例患儿均符合MP感染临床诊断,阳性的临床符合率为100%。结论2种检测方法对MP感染的诊断均有一定的临床价值,IFA对MP感染的检测阳性率及临床符合率均更高;病程>7 d的MP检测阳性率更高;GICA与IFA联合检测均阳性的结果与MP感染的临床诊断一致。病程4~7 d仍需结合临床或联合其他实验室诊断方法进行判断。

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断分析

进一步评估并观察间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断价值与意义。方法 本次研究中将2022年1月~2022年12月期间我院门诊、住院申请双抗链DNA抗体滴度检测的标本共计230例作为研究对象。最终确诊为系统性红斑狼疮患者共计95例,确诊为其他非自身免疫性疾病患者共计135例。分别应用间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮进行诊断,对诊断结果进行观察与分析。结果 间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阳性患者共94例,占比为40.90%;间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共57例,占比为24.80%;间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阴性患者共42例,占比为18.3%。总符合率方面,阳性结果符合率为69.10%,阴性结果符合率为39.40%。对于诊断为系统性红斑狼疮患者而言,95例患者中,间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共17例,间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阳性患者共1例。滴度1:100时,非自身免疫疾病组高于系统性红斑狼疮组,另2组滴度系统性红斑狼疮组高于非自身免疫疾病组;在各个滴度间进行对比,组间差异显著且存在统计学意义。结论 在系统性红斑狼疮临床诊断中,单独进行间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测均存在漏检的可能性,两种方法具有独特优势,不能相互替代。考虑两种方法检测符合率偏低的问题,可以尝试联合同步检测,以面向抗核抗体检测提供可靠结果,配合间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测的联合应用,使临床检测结果更为理想。

间接免疫荧光法及蛋白质印迹法对肺癌患者体内自身抗体的分析

目的：了解肺癌患者血清自身抗体阳性率、细胞内定位及荧光图形特点，探索自身抗体作为肿瘤标志物的可能性。方法：应用间接免疫荧光法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ＩＩＦ）检测 ７７份肺癌以及 １４０份不同年龄段正常人血清中自身抗体。提取人喉癌上皮细胞（Ｈｅｐ－２）蛋白抗原，采用蛋白质印迹法对８１份肺癌患者及５２份正常人血清进行分析。结果：肺癌组和对照组的自身抗体阳性率有显著差别，两组人群的自身抗体阳性率皆随年龄增长而增高（Ｐ＜０．０５），在不同年龄段，肺癌组皆显著高于对照组（Ｐ＜０．０１）。肺癌组和对照组在自身抗体荧光图形、靶抗原细胞内定位上均有明显不同。７４份肺癌患者血清中检测到阳性条带（７４／８１，９１．４％），显著高于对照组（３１／５２，６１．５％），其中大多数与自身免疫性疾病中常见的自身抗体不同，并发现８２．７％（６７／８１）的肺癌患者具有针对相对分子质量初步鉴定为６．５万的靶抗原的阳性条带，该条带仅在２２．２％（１２／５２）的正常人中查及。结论：肺癌患者血清的自身抗体谱与正常人生理性自身抗体谱及自身免疫性疾病中的自身抗体谱不同，进一步研究其靶抗原本质及其生物学意义。

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAb-C65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较。结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%。表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致病性PRRS的确诊提供可靠的验证手段。

间接免疫荧光显微术检测泡桐丛枝病原MLO的研究

以感染类菌原体ＭＬＯ的泡桐组培苗为病原繁殖材料，采用差速离心和Ｐｅｒｃｏｌｌ不连续密度梯度离心来提纯ＭＬＯ作为免疫抗原制备兔抗血清。抗血清经健康汁液吸收后，作为第一抗体，用异硫代氰酸荧光素ＦＩＦＣ标记的羊抗兔免疫球蛋白作为第二抗体，进行间接免疫荧光显微镜检查染病组织中的ＭＬＯ特异性荧光。经与ＤＡＰＩ染色技术比较，找出了适宜的徒手切片和减少非特异性反应的途径。此技术具有灵敏度高、特异性强和测定简便等特点。适用于ＭＬＯ组织定位、组培苗脱毒效果评估、病原株系鉴定和病害检疫等。

检测抗人疱疹病毒6型IgG的间接免疫荧光试验的建立及其应用

目的 :建立检测血清中人疱疹病毒 6型 (HHV 6 )IgG的间接免疫荧光试验 (IFA)。方法 :用HHV 6国内分离株感染人脐带血单个核细胞制备抗原片 ,建立检测HHV 6IgG的IFA方法 ,并用于育龄期妇女血清流行病学调查。结果 :建立的IFA具有特异性。对 116份育龄期妇女血清标本检测表明 ,HHV 6IgG的阳性率为 72 .4 % ,几何平均滴度 (GMT)为 1∶6 1;在孕妇和正常未孕妇女之间 ,以及不同孕期的孕妇之间 ,HHV 6IgG的阳性率和GMT均无差异 (P >0 .0 5 )。结论 :建立了具有特异性的IFA法 ,可用于对育龄妇女HHV

用间接免疫荧光染色法检测鸭病毒性肠炎病毒在人工感染鸭体内的侵染过程和分布规律

用鸭病毒性肠炎病毒(DEV)CHv强毒株感染成年鸭复制鸭病毒性肠炎急性病例,分别于接种后不同时间,取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、食道、十二指肠、胰腺、法氏囊和脑组织,制作切片,应用间接免疫荧光染色法(IFA)检测DEV在鸭体内的侵染过程和分布规律。结果显示:感染后4 h可在脾脏、胸腺和法氏囊中检测到DEV抗原;感染后6 h可在肝脏、食道、十二指肠、直肠及肺脏检测到DEV抗原;IFA对各组织器官中DEV的平均检出率为肝脏46/50、脾脏48/50、肺脏46/50、肾脏0/50、肠道46/50、法氏囊46/50、胸腺47/50、胰腺0/50、大脑0/50、食道44/50、心脏0/50。研究表明:在急性病例中,脾脏、法氏囊、胸腺、食道、肠道、肝脏和肺脏为DEV的主要靶器官;接种后,病毒首先在脾脏、胸腺、法氏囊中出现,然后病毒迅速传播到肝脏、消化道和肺脏中;IFA检测石蜡切片中DEV的方法具有直观、特异性强的优点,是对DEV进行检测和抗原定位的较好方法。

猪圆环病毒间接免疫荧光方法的建立

将接种PCV2且经多次传代的PK-15带毒细胞分散到96孔细胞培养板上,制成抗原诊断板,应用间接免疫荧光技术检测血清中PCV2的抗体。通过对各种反应物的工作浓度与作用时间的优化,建立了PCV2抗体的间接免疫荧光检测技术,可用于PCV2抗体水平的监测,为今后的猪圆环病毒疫苗抗体检测的研究提供了检测方法。

SARS病毒抗体间接免疫荧光检测方法的建立

目的 建立快速检测严重急性呼吸综合征 (SARS)患者血清中特异抗体的间接免疫荧光方法 ,为SARS的临床确诊提供参考依据。方法 用本实验室新分离的SARS冠状病毒BJ0 1和GZ0 1株感染Vero E6细胞 ,待 2 5 %细胞出现病变时 ,用胰蛋白酶消化细胞后以 2× 10 7/ml浓度 4 0 μl的细胞滴到 10孔镀膜的玻片上 ,CO2 温箱培养 4h后丙酮固定。利用制备的抗原片通过间接免疫荧光检测了从北京和广州地区采集的 15 4例临床诊断为SARS的患者和 14例非SARS呼吸系统疾病和 10 0份健康人血清。结果 成功地建立了检测SARS冠状病毒抗体的间接免疫荧光染色方法 ,并对 15 4例临床诊断为SARS的患者的血清标本进行检测 ;SARS冠状病毒抗体阳性 14 2例 ,阳性率为 92 3% ,而 14例非SARS呼吸系统疾病患者和 10 0名健康人血清检测均为阴性。结论 本方法具有良好的特异性和灵敏度 。

猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用

目的建立检测猪血清中流行性乙型脑炎病毒(JEV)IgG抗体的间接免疫荧光试验(IFA)。方法用乙脑病毒感染C6/36白蚊伊蚊细胞制备抗原片,建立检测猪血清中JEV-IgG抗体的IFA方法,并用于猪乙脑血清流行病学调查。结果成功建立特异的猪JEV-IgG的IFA检测方法,并对50份母猪、55份仔猪和65份屠宰猪的血清进行检测。乙脑血清抗体效价≥1:200的分别为88.00%,10.91%和24.62%。结论建立的IFA方法能较好的用于猪血清乙脑流行病学调查。

间接免疫荧光法与ELISA检测抗核抗体、抗双链DNA抗体的比对分析

目的探讨间接免疫荧光法(IIFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗核抗体(ANA)和抗双链DNA(ds-DNA)抗体的异同。方法抽取确诊或疑为自身免疫性疾病患者血清125例,同时采用IIFA法和ELISA法检测ANA82例,抗ds-DNA抗体检测57例,其中14例同时检测ANA和抗ds-DNA抗体。对两种方法检测结果不符者采用免疫印迹法复查抗可溶性核抗原(ENA)。结果82例ANA阳性率IIFA法与ELISA法分别为87.8%和73.17%,差别有统计学意义(P<0.01);57例血清中抗ds-DNA抗体检测阳性率IIFA法与ELISA法分别为77.19%和71.93%,差别无统计学意义(P>0.05)。采用不同cutoff值时两种方法符合率比较,ANA、抗ds-DNA抗体检测结果差别均有统计学意义(P<0.01)。两法对一些稀有核型ANA检测符合率较低,而抗ds-DNA抗体的符合率在不同核型上没有差异。ANA检测以1:100为cutoff滴度,抗ds-DNA抗体以弱阳性为cutoff值时,两种方法可获得较高的符合率,但在检测滴度1:100ANA、弱阳性抗ds-DNA抗体时两种方法存在明显的不一致。结论IIFA法检测总ANA、抗ds-DNA抗体的敏感性均高于ELISA法,IIFA法作为ANA的筛查方法,阳性标本再进行ELISA法检测,可在获得荧光核型信息同时观察抗体滴度的变化情况,并且更快捷经济。两种或多种不同方法学原理的实验互相佐证,有助于减少实验误差。

间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌

建立了凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌的间接免疫荧光抗体检测方法。确定免疫血清和荧光抗体的最适工作浓度分别为1∶1000和1∶200;交叉反应和阻断试验表明该方法具有较高的特异性。用该方法检测了10份人工感染后发病的凡纳滨对虾和10份感染后外观健康的凡纳滨对虾,阳性检出率分别为100%和60%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义,而且该方法具有快速、特异、简单的优点,适合于现场应用推广。

间接免疫荧光抗体法对鸡传染性支气管炎病毒进行抗原定位

应用间接免疫荧光抗体（ＩＦＡ）法对ＩＢＶ感染后ＳＰＦ鸡不同脏器进行了跟踪检测。结果发现，在ＩＢＶ感染后的第７天，在气管、肾脏、脾脏、肺脏和肝脏等组织细胞中均不同程度地出现特异性的荧光。表明在感染的初期，ＩＢＶ具有广泛的组织嗜性；在感染的第１０天，只有肾脏、气管或肺脏中呈现荧光，而以肾脏中的荧光最强，特异性荧光持续时间最长的是肾脏，可达１４天，病毒存在于肾小管间质内浸润的淋巴细胞和巨噬细胞胞浆中。实验结果证实，ＩＦＡ方法具有直观、特异等特点，在抗原定位上具有独特的优点。

利用间接免疫荧光染色和协同凝集技术检测梨火疫病菌

提取梨火疫病菌 (0 0 5 6菌株 )的脂多糖免疫家兔 ,获得抗血清 ,建立了检测梨火疫病菌的间接免疫荧光染色和协同凝集检测技术 ,对梨火疫病菌的不同菌株和人工接种发病样品实施了检测。结果表明 ,这 2种方法可以准确、灵敏地检测梨火疫病菌及样品 ,方法简单、快速、实用 ,可以在中国口岸推广使用 ,减少梨火疫病进入中国的风险。

检测猪捷申病毒抗体的间接免疫荧光方法的建立与初步应用

为建立检测猪捷申病毒(PTV)抗体的方法,本研究利用PTV-8 Jilin/2003株为抗原,建立了检测PTV抗体的的间接免疫荧光技术(IFA)方法。该方法工作浓度分别是:一抗最适稀释度为1∶10;FITC标记二抗最适稀释度为1∶100;二抗中伊文氏兰最适稀释度为1∶30 000。敏感性试验、特异性试验表明该抗原板可以检出包含PTV-8型和1型在内的的所有PTV阳性血清,方法敏感、特异。与SN符合率94.0%。用该方法对黑龙江、山东、天津和河南等地的1 500份临床血清样品进行检测,阳性检出率为55.8%,表明我国猪群中PTV的感染已经非常普遍。该方法做为PTV的血清学诊断新技术,为开展PTV分子流行病学调查奠定了基础。