骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究

目的观察骨髓间质干细胞(BMSCs)和脐血间质干细胞(CMSCs)联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症(DMD)的临床疗效。方法2007年6月—2009年3月对269例DMD患者行自体BMSCs和CMSCs联合移植方案进行治疗,患者均使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),5～10μg/kg,2次/d,皮下注射动员骨髓干细胞4d,于第5天行骨髓采集术,局部麻醉下从髂后上棘抽取骨髓100～180ml。将采集的骨髓液经Ficoll密度梯度离心后,分离单个核细胞2.0×109,用Uitra cul Ture培养液调节细胞数量为1×105/ml～1×106/ml,接种于75mm2培养瓶中,24h换液,7～10d后收集全部细胞,总数为4.0×108/ml～1.5×109/ml。将BMSCs移植到患者四肢近端肌肉内。采集脐血80～160ml,Ficoll密度梯度离心,分离单个核细胞并诱导分化为CMSCs。将CMSC(1.0～4.8)×107细胞悬液,经静脉缓慢输注,每5～7d1次,共3次。移植后6个月对患者的肌力、步行10m和推轮椅10m所需时间、肌酸激酶水平、肌电图等进行观察。结果269例患者移植后6个月时随访,218例患者(81.0%)肌力有不同程度的增加。干细胞移植后235例患者复查心肌酶谱,其中188例(80%)患者步行10m及推轮椅10m所需时间明显缩短,与移植前比较差异有统计学意义(P<0.05),干细胞移植后患者肌酸激酶水平较移植前明显下降(P<0.01)。51例患者复查肌电图,32例(62.7%)患者波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少。47例患者复查大腿肌肉磁共振成像,肌肉影像较移植前变化不明显。结论BMSCs和CMSCs移植治疗DMD,对肌肉组织有一定的修复作用,使DMD患者的运动功能得到改善,肌力有所提高,肌酸激酶较移植前下降。移植后复查肌电图波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少。MSCs移植无不良反应,患者依从性好,是治疗DMD的新手段。

养血固肾汤通过刺激骨髓间质干细胞对破骨细胞形成的调控及对IGF1R-PI3K-AKT信号通路的作用

目的分析养血固肾汤通过刺激骨髓间质干细胞(BMSCs)对破骨细胞形成的调控及对胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)-磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路的作用。方法选取SPF级健康雌性SD大鼠30只,破骨细胞动物SPF级健康雌性SD大鼠(鼠龄15~20 d)。30只SD大鼠随机选取10只分为假手术组,另外20只建立骨质疏松模型,成功18只,随机分为模型组和养血固肾汤组各9只。养血固肾汤组给予8.3 ml养血固肾汤煎液(1 ml/100 g)灌胃,假手术组、模型组均给予1 ml/100 g纯净水灌胃干预。BMSCs培养后建立BMSCs与破骨细胞共同培养,分为假手术+OC组、模型+OC组、养血固肾汤+OC组。观察破骨细胞形态,检测IGF1R-PI3K-AKT信号通路相关蛋白。结果养血固肾汤+OC组破骨细胞数量高于假手术+OC组,明显低于模型+OC组(P<0.05)。与假手术+OC组相比,模型+OC组IGF1R、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)3蛋白表达明显升高,PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表达明显降低;养血固肾汤+OC组IGF1R、Bax、Caspase3蛋白表达明显降低,PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。养血固肾汤+OC组IGF1R、Bax、Caspase3蛋白表达明显低于模型+OC组,PI3K、p-AKT、Bcl-2蛋白表达明显高于模型+OC组(P<0.05)。结论养血固肾汤通过刺激调控BMSCs细胞,激活IGF1R-PI3K-AKT信号通路抑制破骨细胞分化形成。

miR-21通过调节TGF-β/activin信号通路影响人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的机制

目的研究miR-21调控转化生长因子(TGF)-β/activin信号通路对人骨髓间质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞的影响。方法将BMSCs培养后分为空白对照组(无转染)、miR-21过表达组(转染miR-21 mimics)及miR-21敲低组(转染miR-21 inhibitor)后对细胞进行转染,TGF-β/激活蛋白(activin)信号通路上miR-21的靶基因为TGF-β受体Ⅱ(TGF-βR2)、TGF-β1,RT-PCR检测miR-21、TGF-βR2、TGF-β1、骨特异性转录因子(Runx2)、成骨细胞特异基因(Osterix)mRNA;Western印迹检测TGF-βR2、TGF-β1、Runx2、Osterix蛋白;检测成骨细胞钙沉积、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨桥蛋白(OPN)的表达。结果与空白对照组相比,miR-21过表达组中TGF-β1与TGF-βR2 mRNA及蛋白的表达均显著上升(P<0.05),而miR-21敲低组中TGF-β1与TGF-βR2 mRNA及蛋白的表达显著降低(P<0.05)。miR-21与TGF-β1、TGF-βR2基因均呈正相关(r=0.568,P<0.05;r=0.627,P<0.05)。与miR-21敲低组、空白对照组对比,miR-21过表达组可以显著提高ALP的活性、相同时间内钙沉积较明显并且其PCR扩增产物也较长。miR-21过表达组中Rumx2与Osterix mRNA及蛋白的表达较对照组显著上升(P<0.05),而miR-21敲低组中成骨细胞Rumx2与Osterix mRNA及蛋白的表达较空白对照组和miR-21过表达组显著降低(P<0.05)。miR-21与成骨细胞相关基因Rumx2、Osterix均呈正相关(r=0.627,P<0.05;r=0.516,P<0.05)。结论miR-21能够促进BMSCs分化为成骨细胞,其机制可能是通过上调TGF-β/activin信号通路中TGF-β1、TGF-βR2的表达。

脑卒中血清培养骨髓间质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注的影响

目的观察脑卒中血清预处理的骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)移植对大鼠脑缺血再灌注的影响。方法分离培养骨髓MSCs并观察细胞形态,流式细胞术检测CD44、CD90、CD34、CD45抗原表达以鉴定细胞。分离缺血性脑卒中和正常大鼠血清,与MSCs共培养,制备SS-MSCs(脑卒中血清),NS-MSCs(正常脑组织血清)及FBS-MSCs(胎中血清)。Zea Longa线栓法制作MCAO大鼠模型,MSCs经尾静脉注射移植,分为MCAO组(等体积PBS)、MCAO+FBS-MSCs组(2×10^(6) cells FBS-MSCs)、MCAO+NS-MSCs组(2×10^(6) cells NS-MSCs)、MCAO+SS-MSCs组(2×10^(6) cells SS-MSCs),并设sham组(等体积PBS)。监测大鼠MSCs移植后第1、7、14天行为变化。TTC、HE、Tunel染色观察脑组织梗死情况、组织状态及细胞凋亡情况。ELISA检测脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平。同时行免疫组织化学染色观察BrdU、BDNF、NGF表达。结果成功分离高纯度MSCs,分组预处理移植后,与MCAO组比较,各干预组第7、14天双侧贴纸去除时间、mNSS评分均降低,MCAO+SS-MSCs组行为改善最显著(P<0.01)。TTC、HE、Tunel染色结果显示与MCAO组比较,MSCs移植干预均可降低大鼠脑梗死面积,改善脑组织损伤,抑制细胞凋亡,且MCAO+SS-MSCs组改善程度最大(P<0.05)。此外,MCAO+SS-MSC组BDNF、NGF、HGF、VEGF水平较MCAO组升高(P<0.01),且高于其他干预组(P<0.05)。免疫组化结果显示MCAO+SS-MSC组Brdu、BDNF、NGF表达水平较MCAO组升高(P<0.05),且高于其他干预组(P<0.05)。结论脑卒中血清预处理骨髓MSCs移植可有效改善MCAO大鼠脑组织损伤,可通过抑制脑组织细胞凋亡,上调BDNF、NGF、HGF、VEGF水平,发挥保护作用。

小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

背景:以往相关报道大多为成人或者动物骨髓间质干细胞,关于儿童骨髓间质干细胞体外培养及定向分化的研究相对较少。目的:探讨儿童骨髓间质干细胞诱导分化为神经干细胞及神经元细胞的能力。方法:取传12代儿童骨髓间质干细胞,加入预诱导液(含体积分数为10%胎牛血清及1 mmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM培养液)、诱导液(含2%二甲基亚砜及150μmol/L丁基羟基茴香醚的DMEM培养液)进行定向诱导分化。诱导后30 min,7 d,免疫细胞化学检测神经干细胞特异性抗原nestin、神经丝蛋白β-tublinⅢ的表达,诱导后0,5.5,6 d,RT-PCR检测nestin m RNA的表达。结果与结论:(1)经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚联合诱导之后,细胞胞体逐渐收缩为锥形和多角形、类圆形,胞体伸出突起并逐渐延长为细丝状。联合诱导至第6天,相邻细胞突起发生交互,形成网状;(2)诱导30 min后,nestin抗原表达呈阳性,诱导7 d后,β-tublinⅢ表达呈阳性;(3)诱导开始时(0 h)未出现nestin mRNA表达,诱导5.5 h时nestin mRNA表达呈阳性,诱导6 d时不再表达;(4)结果表明,小儿骨髓间质干细胞经二甲基亚砜、丁基羟基茴香醚体外联合诱导可分化为神经干细胞与神经元细胞。

成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞前后基因表达的研究

目的探讨成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞前后基因表达的变化。方法从成人骨髓分离MSC,培养扩增。用参芪液诱导hMSC分化为神经元,并用免疫组化法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定是否为神经元样细胞。采用半定量RTPCR方法检测10个基因(包括内胚层基因Ceruloplasmin;中胚层基因SM22;外胚层基因Amyloidprecursorprotein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因NeuroD、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化前后的变化。结果hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化结果显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性。hMSC在分化前表达内胚层、中胚层、外胚层和生殖系基因,随着分化时间的延长,生殖系基因不表达,内胚层和中胚层基因表达减弱,外胚层基因表达基本不变。而在分化过程中外胚层基因和神经元特异性标记基因表达明显增强。结论hMSC分化为神经元样细胞的过程并不是简单的神经特异性基因的“开”和“关”,而是与神经细胞分化成熟过程中相关基因表达的量相关。

脂肪间质干细胞在心肌缺血性疾病中的应用

脂肪间充质干细胞来源于脂肪组织,易于体外分离培养,大量扩增.很多临床前及临床研究已经证实其可以通过分化为心肌样细胞,促血管生成、旁分泌等作用参与心肌梗死后组织修复,改善心脏功能.脂肪间充质干细胞是理想的心肌再生治疗的细胞来源.就相关领域研究现状及进展作一综述.

骨髓间质干细胞移植对梗死心肌的影响

目的探讨自体骨髓间质干细胞移植对梗死心肌基本结构及心肌收缩力的影响。方法贵州香猪24只,随机分为对照组和实验组,每组12只。抽取骨髓3 mL,按照W ak itan i方法培养出骨髓间质干细胞,经5-氮胞苷诱导后,5-溴脱氧尿苷标记备用。开胸结扎左冠状动脉前降支后,实验组第三代自体骨髓间质干细胞分别注射至结扎的左冠状动脉前降支和远端多点注入急性心肌梗死区域;对照组以同样方法注射DMEM。术后3、6周取标本,组织切片染色,观察组织基本结构;体外药物刺激离体肌条,检测心肌收缩情况。结果VG染色显示实验组胶原纤维融合较少,组织结构排列基本处于有序状态。实验组心肌收缩力明显高于对照组(P<0.001),且随时间推移恢复程度增加(P<0.05)。结论自体骨髓间质干细胞梗死心肌移植可以增加心肌细胞的收缩力,调节组织内胶原纤维的含量和组成,防止心室重构,从而起到对心肌基本结构的保护作用。

成人骨髓间质干细胞定向诱导为神经元样细胞的研究

目的 :体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法 :采用Ficoll -Paque液 (1 0 77× 10 3 g/L)离心分离成人MSC ,体外扩增 ,分别采用含巯基乙醇和硫代甘油等试剂的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增 5代可获 5× 10 7个细胞。加入巯基乙醇等或硫代甘油等诱导剂诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF表达阳性 ,GFAP阴性。结论 :成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。

丹参酮ⅡA定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 :丹参酮ⅡA体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法 :采用Fi coll-Paque液离心和贴壁法分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达 ,FGF - 2对MSC增殖和分化的影响。采用含丹参酮ⅡA的无血清达乐伯克改良必需基本培养基 (DMEM)诱导MSC分化为神经元样细胞 ,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF -M)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。结果 :成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 0 5× 10 6,15代可获得 ( 2 - 3)× 10 12 个细胞 ,流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD4 4、CD90、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD4 5、CD80、CD86为阴性。FGF - 2促进hMSC生长 ,并且对MSC的分化能力基本没有影响。丹参酮ⅡA诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF -M、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。结论

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 :探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞的影响。方法 :通过贴壁法分离大鼠MSC ,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶 (NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白 (Nestin)。结果 :大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导 2h后大部分可分化为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论 :大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。

骨形成蛋白-2基因转染人骨髓间质干细胞诱导异位成骨的实验研究

目的 评价腺病毒介导的人骨形成蛋白 - 2基因 (Adv- h BMP- 2 )转染人骨髓间质干细胞 (MSCs)的诱导成骨能力。方法 从人骨髓中分离培养获取 MSCs,分为三组 :1Adv- h BMP- 2转染细胞组 ;2 Adv- βgal转染细胞组 ;3未转染细胞组。分别于体外行 Western immunoblot试验、碱性磷酸酶 (AL P)和 Von Kossa染色、AL P定量测定 ,以及裸鼠肌内诱导成骨试验。共 9只裸鼠 ,双侧股后肌群内注射 ,每组 6侧。结果 Adv- h BMP- 2组 MSCs可分泌 BMP- 2蛋白 ;转染后第 9天 AL P染色多数细胞为阳性 ,其它两组 AL P染色阳性细胞少见 ;AL P活性第 3天开始升高 ,12天达高峰为 14 .76单位 ,与其它两组比较有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;于第 2 1天后出现钙结节 ,而其它两组未见。裸鼠肌内注射后 4周 Adv- h BMP- 2组 X线片均有异位成骨 ,Adv- βgal转染细胞组未见明显成骨 ,未转染细胞组仅有少量骨形成。组织学检查发现 :Adv- h BMP- 2组也可见典型的板层骨和骨髓腔形成 ,Adv- βgal组主要为纤维组织 ,未转染组也可见散在骨小梁形成。结论 Adv- h BMP- 2基因转染可诱导人骨髓间质干细胞成骨。

参芪扶正注射液诱导成人间质干细胞治疗脑梗塞的实验研究

目的观察参芪扶正注射液(简称参芪液)诱导成人间质干细胞(hMSCs)在脑梗塞大鼠脑内的分化及其对模型大鼠神经功能的影响。方法建立左大脑中动脉梗塞模型大鼠,将在体外扩增的hMSCs经参芪液诱导0.5h后注入模型大鼠脑内,观察hMSCs在大鼠脑内的存活、分化及对模型大鼠神经功能的改变。结果hMSCs移植排斥反应低,可在大鼠脑内存活6周以上;移植前后脑梗塞面积无明显变化;免疫组化表明hMSCs在大鼠脑内表达人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP);模型大鼠的肢体运动功能和触觉功能均有改善。结论参芪液可诱导hMSCs在体内分化为神经元,hMSCs有可能成为治疗脑梗塞的理想的种子细胞。

人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞 (mesenchymalstemcell,MSCs)是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞 ,在体外不仅可分化为间质类细胞 ,而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为 1.0 73g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞 ,以含 10 %胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs ,细胞纯度可达 95 %左右。取第二代和第三代的MSCs ,以含有不同浓度的抗坏血酸、β 磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导 ,诱导后的细胞呈现典型的成骨细胞样改变 ,免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性 ,ALP染色阳性 ,表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。

骨髓间质干细胞降低大鼠移植物抗宿主反应的实验研究

目的探讨MSCs对GVHD的作用及其机制。方法建立大鼠同种异体骨髓移植模型,同时输入供者的T淋巴细胞诱导出移植物抗宿主反应,联合或不联合移植供体来源的MSCs,观察受鼠的生存时间,同时利用RT-PCR法研究Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,用ELISA法检测移植后体内IL-4细胞因子的浓度。结果GVHD组的平均生存时间为(17.30±2.33)天,实验组的平均生存时间为(24.10±2.36)天,与单独移植HSCs相比,MSCs与HSCs共移植明显延长的受鼠的生存时间。同时,GVHD组Th1/Th2细胞比值为1.29±0.06,IL-4因子的浓度平均为(14.84±2.59)pg/mL,实验组Th1/Th2细胞比值为(0.77±0.14),IL-4因子的浓度平均为(40.09±13.99)pg/mL。MSCs与HSCs共移植降低了体内Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,提高了体内IL-4细胞因子的浓度。结论MSCs与HSCs共移植能有效抑制HSCs移植后致死性GVHD的发生,延长生存时间,同时MSCs可能通过作用于体内Th1/Th2淋巴细胞亚群的比例,促进体内IL-4细胞因子的分泌从而间接发挥了抑制GVHD的作用。

丹参注射液诱导间质干细胞分化为神经元样细胞

【目的】丹参注射液体外定向诱导成人骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。【方法】采用Ficoll Paque液离心分离成人MSC ,体外扩增 ,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达 ,分别采用含丹参注射液或硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基 (DMEM )诱导MSC分化为神经元 ,免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白(NF M )、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)、巢蛋白 (nestin)的表达。【结果】成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 0 5× 10 6,15代可获得 (2～ 3)× 10 12 个细胞 ,细胞流式细胞仪检测结果显示CD2 9、CD44、CD90、CD10 5、CD16 6表达阳性 ,CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入丹参或硫代甘油诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF M、nestin表达阳性 ,GFAP阴性。

骨髓间质干细胞复合多孔磷酸钙陶瓷修复兔颅骨缺损的研究

目的 探讨以骨髓间质干细胞 (MSCs)作为种子细胞、β-磷酸三钙 (β- TCP)多孔生物陶瓷作为支架材料构建组织工程化人工骨 ,修复兔实验性颅骨标准缺损的可行性。 方法 选择 5月龄新西兰大白兔 34只 ,制作颅骨标准缺损后分成 3组。A组 (n=2 0 ) :分离培养兔同胎异体 MSCs,体外扩增后接种到预制的 β- TCP多孔生物陶瓷材料上 ,细胞 -材料复合体经体外孵育后 ,无菌条件下植入颅骨缺损 ;B组 (n=10 ) :采用单纯β- TCP材料修复兔颅骨缺损 ;C组(n=4 ) :兔实验性颅骨标准缺损区未做骨修复。术后 6周和 12周分别处死动物、取材 ,进行缺损区大体、组织学、组织化学和免疫组织化学分析。 结果 颅骨缺损处 A组术后 6周表面肉眼可见骨样组织形成 ,组织学提示材料部分降解 ,未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生骨组织 ,成骨细胞外基质丰富 , 型胶原染色阳性 ;术后 12周 ,支架材料几乎完全降解 ,缺损区被新生骨组织所取代。B组术后 6周 ,可见从缺损区边缘有新生骨组织向支架材料内长入 ,支架材料部分吸收 ;术后 12周 ,可见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生骨组织逐渐增多 ,但材料的中心部位未发现新生骨形成。C组术后 12周 ,仅见少量骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入 ,缺损中央大部分区域未得到修复。

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的 建立一种体外分离、培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法 ,探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点 ,为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础。方法 分离 5～ 6周龄的小鼠胫骨、股骨 ,用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓 ,经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞 ,接种后 1 2～ 1 6d形成单层贴壁的成纤维状细胞。体外多向诱导分化鉴定分离的细胞 ,用传代的细胞进行生长曲线的测定、观察其接种贴壁率、检测细胞周期和超微结构。结果 体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力 ;MSCs倍增时间约为 3 8h ,传代后 1 2h贴壁达 90 %以上 ,细胞周期显示有 80 %细胞处于G0 G1 期 ,并用电镜照片显示其超微结构。结论 在本实验条件下 ,体外培养的MSCs具有多向分化潜能 ,体外生长稳定 ,传代后的细胞适应性强 ,增殖较快 ,超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点。

人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究

目的 :探讨经体外扩增、诱导分化的人骨髓间质干细胞(humanbonemarrowmesenchymalstemcells,hMSC)作为组织工程化骨、软骨种子细胞的可行性。方法 :体外分离、培养、扩增hMSC ,以流式细胞仪检测hMSC的表面抗原。诱导hMSC向成骨细胞、软骨细胞分化。以倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态 ;以组织化学、免疫组织化学和RT PCR ,检测成骨细胞、软骨细胞的特异性标志物。结果 :分离得到的细胞可表达hMSC的特异抗原 ,在体外扩增 15代以上 ,其形态及表面抗原保持不变。成骨诱导培养的细胞上清液中ALP的含量高于对照组 (P <0 .0 5 )。成骨及成软骨诱导的细胞形态均由成纤维样梭形向多边形转变。透射电镜观察可见大量扩张的粗面内质网、高尔基体及线粒体。扫描电镜观察可见经成骨诱导后的细胞表面有钙盐沉积 ,成软骨诱导的细胞表面有胶原样突起。成骨诱导培养后 ,可见碱性磷酸酶 (ALP)染色、Ca结节染色、胶原 Ⅰ (COL Ⅰ )及骨钙素 (osteocalcin ,OC)免疫组化染色阳性 ,同时RT PCR检测COL Ⅰ、OCmRNA表达阳性。成软骨诱导后 ,甲苯胺蓝染色见细胞周围有大量的异染性基质 ,免疫组化和RT PCR检测COL Ⅱ表达阳性。结论 :hMSC在体外可大量扩增。在特定培养液诱导下 ,可向成骨细胞及软骨细胞转化 ,可作为骨。