液相阻断ELISA和固相阻断ELISA检测O型口蹄疫抗体的比较

口蹄疫抗体检测是评价口蹄疫疫苗免疫效果和病毒感染状况的重要指标。液相阻断ELISA是检测口蹄疫抗体的经典方法,而固相阻断ELISA以其简便、快速的检测特点被广泛应用。为比较液相阻断ELISA和固相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的应用效果,采用改进型液相阻断ELISA和固相阻断ELISA对273份临床猪血清样品进行O型口蹄疫抗体检测,并对两种方法检测结果进行统计学分析。结果表明:固相阻断ELISA检测抗体阳性率为77%,液相阻断ELISA检测抗体阳性率为75%,两者检测结果符合率为95%,Kappa值为0.86,属于完全符合。进一步分析156份样品的液相阻断ELISA效价与固相阻断ELISA S/N值对应关系,发现S/N值随效价的升高而减小,阴性组(效价<64)S/N值对应中位数0.568,弱阳性组(1∶64≤效价<1∶720)S/N值对应中位数0.093,强阳性组(效价≥1∶720)S/N值对应中位数0.045。结论:两种ELISA方法对猪血清样品的检测结果高度一致,固相阻断ELISA可替代液相阻断ELISA用于O型口蹄疫样品的检测。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

猪弓形虫病阻断ELISA方法的建立及初步应用

本研究利用制备的GRA7单克隆抗体为基础建立猪弓形虫病的阻断ELISA方法。以rGRA7重组蛋白免疫小鼠,取脾细胞进行细胞融合,筛选出4株能够稳定产生单克隆抗体的阳性单克隆细胞株。经对此单克隆抗体进行IFA和Western blot检测确认成功制备GRA7蛋白的单克隆抗体后,以重组蛋白为包被抗原对阻断ELISA方法进行优化后,经过重复性、交叉性、符合性实验验证本方法具有可重复性,与MAT符合性高。初步应用于288份临床样品检测,检出率为11.46%,与MAT检测结果重合率为84.8%。本研究成功制备弓形虫GRA7蛋白的单克隆抗体,并建立了一种猪弓形虫病的阻断ELISA方法,为弓形虫病的检测提出了新的方案。

禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

为建立检测禽呼肠孤病毒(ARV)血清抗体阻断ELISA方法,试验采用浓缩的ARV-AH20株病毒粒子免疫5周龄BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞,并通过间接ELISA和免疫荧光试验(IFA)进行阳性杂交瘤细胞亚克隆筛选,获得两株稳定分泌针对σC蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株H9B2D77、B4E4B10。选择H9B2D77株作为检测抗体、重组σC蛋白作为包被抗原,经条件优化,建立了一种检测ARV抗体的阻断ELISA方法。结果显示:该方法与常见鸡源病原的抗体阳性血清均不存在交叉反应,批间和批内变异系数均小于6%;对48份鸡血清样品的检测,该方法与IFA具有100%的总体符合率。综上所述,基于禽呼肠孤病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法特异性高,重复性好,可用于ARV抗体检测。

非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同温度保存下对实验结果的影响

目的:比较非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒在不同低温保存下对检测结果的影响。方法:将同一生产厂家同一批号的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒分别置于4℃和-18℃下保存24 h以上后对养殖场送检的12份猪血清样品进行检测,比较其OD值和结果差异。结果:这两种储存温度下的实验均成立且判定结果一致,但OD值存在一定的偏差。

液相阻断ELISA口蹄疫抗体检测原理及技巧

口蹄疫是一种严重威胁(如猪、牛、羊等)偶蹄目动物健康的一类传染性动物疫病,给猪牛羊等养殖场/户带来巨大的经济损失。县级兽医实验室口蹄疫抗体检测是我国基层动物防疫部门防控口蹄疫的重要方法,准确检测出当地猪牛等动物的口蹄疫抗体水平,对预防和控制当地口蹄疫疫病具有重要的指导作用和参考意义。

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验。用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%。另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%。表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重。

氯霉素残留检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定

在建立氯霉素单克隆抗体(CAP mAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上,研制出CAP残留快速检测试剂盒(CAP-kit),并对其性能进行了测定。结果表明,CAP-kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.9953,检测范围为1.0μg/L～128.0μg/L,灵敏度为0.85μg/L,半数抑制浓度(IC50)为7.54μg/L,检测限为1.0μg/L;牛奶样、猪肉样的平均添加回收率为88.3%、82.5%,平均批内和批间变异系数均<15%;CAP-kit与氯霉素琥珀酸钠的交叉反应(CR%)为150%,与其它酰胺醇类和抗菌素药物无交叉反应;试剂盒在4℃可保存6个月。

莱克多巴胺单克隆抗体的研制及阻断ELISA检测方法的建立

用混合酸酐法将莱克多巴胺（RAC）偶联于牛血清白蛋白（BSA）,合成免疫原BSA-RAC,并用紫外和凝胶电泳鉴定;用BSA-RAC免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立抗RAC单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备RAC mAb。应用RAC mAb研制RAC残留快速检测阻断ELISA试剂盒（RAC-Kit）,并测定其性能。结果表明,BSA-RAC偶联成功,分子结合比为1∶24.5;筛选出3株杂交瘤细胞,其中最好的4D8株的亲和常数Ka为1.65×1010L/mol。RAC-Kit的标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,线性范围为1~170μg/L,灵敏度为0.52μg/L,检测限为1μg/L,饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为91.1%和89.2%,平均批内和批间变异系数〈15%,与多巴酚丁胺的交叉反应率为22.3%,与其他化合物无交叉反应,RAC-Kit在4℃可保存180d。

恩诺沙星多克隆抗体制备及阻断ELISA检测方法的研究

采用混合酸酐法将恩诺沙星（ENR）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原（ENR—BSA）和包被抗原（ENR—OVA）．将免疫原免疫家兔，制备多克隆抗体（ENRpAb），应用ENRpAb研制ENR残留阻断ELISA快速检测方法，并对其灵敏度、半数抑制浓度IC50、特异性、准确度进行测定．结果阻断ELISA的线性检测范围为1～205ng／mL，灵敏度1ng／mL，半数抑制浓度（IC50）为11ng／mL，与其他化合物的交叉反应率（CR％）均〈0．1％，鸡肉样的平均添加回收率分别为87．35％，平均变异系数均〈10％．本检测方法具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合ENR残留快速检测的推广应用．

磺胺二甲基嘧啶残留快速检测阻断ELISA试剂盒的研制及其性能测定

应用磺胺二甲基嘧啶(SM2)单克隆抗体(mAb)成功研制出SM2残留快速检测阻断ELISA试剂盒(SM2-Kit)。研究结果表明,SM2-Kit的标准曲线呈典型的S型,相关系数R2=0.9911,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为0.625μg/L～80μg/L,灵敏度为0.9μg/L,半数抑制浓度(IC50)为5.82μg/L,检测限为1μg/L;饲料样、猪尿样的平均添加回收率分别为83.4%、89.5%,平均批内和批间变异系数均低于15%;SM2-Kit与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率(CR%)为2.08%,与其它磺胺类药几乎没有反应性;基质对SM2-Kit的检测结果影响不大;试剂盒在4℃可保存6个月。

液相阻断ELISA在口蹄疫病毒抗体水平检测中的应用

分别利用口蹄疫病毒Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法,对健康猪、牛、羊血清,O型、Asia-I型免疫血清,以及人工感染Asia-I型FMDV的猪、羊血清和人工感染O型FMDV牛血清进行了抗体水平检测,同时利用3ABC-I-ELISA对液相阻断ELISA方法所选的部分阴性血清进行了验证试验.结果显示:利用Asia-I型和O型液相阻断ELISA方法筛选的阴性动物,在免疫和攻毒后,血清抗体水平显著升高,表明该法可完全用于口蹄疫阴性动物筛选及口蹄疫病毒抗体水平的检测.

新霉素阻断ELISA试剂盒的研制与应用

本研究旨在建立新霉素(Neomycin,NEO)免疫学检测试剂盒。以制备的抗NEO单克隆抗体(NEO mAb)为基础,建立阻断ELISA分析方法,组装新霉素阻断ELISA试剂盒,并对试剂盒的性能进行鉴定。结果表明,NEO试剂盒(NEO-kit)标准曲线呈典型的S型,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R2=0.990 3;检测范围为1.0～64.0μg.L-1,半数抑制浓度(IC50)为2.59μg.L-1,灵敏度为0.75μg.L-1,检测限为1.0μg.L-1。试剂盒除了和NEO阳性样品反应呈阳性外,与庆大霉素、链霉素、土霉素、沙丁胺醇、环丙沙星、二氟沙星、磺胺嘧啶及磺胺甲噁唑等其他药物均无交叉反应性。奶样、饲料样及肉样的平均添加回收率为89.50%、89.58%和87.92%;平均批内和批间变异系数均小于15%,而且批间变异系数小于批内变异系数;基质对NEO-Kit的检测结果影响比较小;NEO-Kit在4℃可保存6个月以上。试剂盒和HPLC-MS-MS对牛奶中新霉素回收率没有显著差异(P≥0.05)。试剂盒和HPLC-MS-MS对饲料样检测结果也无显著差异(P≥0.05)。本研究成功研制出敏感、特异、准确的NEO检测试剂盒。

酶标单抗阻断ELISA检测鸡白痢和鸡伤寒抗体

以辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌O9单抗3-47-0与包被的鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种抗体阻断EL ISA以检测鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌感染。该方法基于待检血清样品抑制酶标单抗与脂多糖的结合,以检测鸡白痢和鸡伤寒特异性抗体。对72份已知鸡白痢阳性血清(抑制率为(98.5±4.0)%)、54份已知鸡白痢阴性血清(抑制率为(15.3±8.0)%)、42份SPF鸡血清(抑制率为(0.8±7.2)%)检测的结果表明,该方法具有很强的区分能力。在人工感染试验中,从第2周开始,该方法能从全部鸡只中检测到特异性抗体,比全血玻板凝集试验(PAT)早1周时间。对344份种鸡血清的检测结果表明,单抗阻断EL ISA比PAT特异性好、敏感性高。另外,该方法也能检测出与鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌有共同抗原的沙门氏菌感染产生的抗体。

部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查

采用单抗阻断ELISA法对我国部分省市不同品种、不同类型的鸡群进行了鸡白痢、鸡伤寒的血清流行病学调查。结果,在2309份鸡血清样品中检出阳性359份,阳性率为15.5%,不同鸡场鸡群感染率悬殊较大,从0到54.5%不等。表明,我国鸡群中鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌的流行呈现多样化。

磺胺甲噁唑残留检测阻断ELISA试剂盒的研制

在建立磺胺甲噁唑单克隆抗体（SMZmAb）杂交瘤细胞株和阻断ELISA方法的基础上，研制出SMZ残留快速检测试剂盒（SMZ—Kit），并对其性能进行了测定。结果表明，SMZ—Kit的标准曲线呈典型的S型，符合4参数logit曲线拟合，相关系数R^2=0，9901，检测范围为1．0～128．0μg／L，灵敏度为0．73μg／L，半数抑制浓度（IC50）为11．5μg／L，检测限为1．0μg／L；饲料样、牛奶样的平均添加回收率为83．9％，83．3％，平均批内和批间变异系数均〈15％；SMZ—Kit与磺胺嘧啶的交叉反应（CR％）为2．88％，与其他磺胺类药物无交叉反应；试剂盒在4℃可保存6个月。

检测PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法的建立

用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达PRRSV重组N蛋白作为包被抗原,建立检测猪群PRRSV抗体的间接阻断ELISA方法,并对临床上采集的256份猪血清样本进行检测,结果66份呈阳性,用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒检测,检出的阳性血清为63份,两者的符合率为98.8%。Western blot检测结果58份阳性,两者的符合率为96.9%。试验结果表明,本试验所建立的间接阻断ELISA方法具有良好敏感性和特异性,可用于PRRS流行病学调查和疾病的诊断。

磺胺嘧啶残留阻断ELISA试剂盒的研制及鉴定

基于1株分泌抗磺胺嘧啶(sulfadiazine,SD)高亲和力的SD单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),应用ELISA试验原理研制SD残留快速检测阻断ELISA试剂盒(SD-Kit),并对其特性进行测定。SD-Kit的标准曲线呈典型的S型,相关系数R2=0.9914,符合4参数logit曲线拟合,线性检测范围为0.02～12.92μg/L,灵敏度为0.08μg/L,半数抑制浓度(IC50)为0.54μg/L,检测限为0.08μg/L;鲜奶样和猪尿样的平均添加回收率分别为90.8%、95.8%,平均批内和批间变异系数均低于10%;基质对SD-Kit的检测结果影响不大;SD-Kit与磺胺甲基嘧啶的交叉反应率为2.7%,与其他磺胺类药几乎没有反应性;试剂盒在4℃可保存6个月。

鸡传染性鼻炎PCR和阻断ELISA试剂盒的研制与应用

用鸡传染性鼻炎 PCR试剂盒可直接检测病料中的病原 DNA，可测出 1 pg的 DNA和 102～ 103个细菌，对可疑病料的检出率是传统的细菌分离方法的 2～ 3倍，可重复性好，特异性为 100％，在 4℃可保存 12个月，在－ 20℃可保存 15个月。阻断 ELISA试剂盒可检测副鸡嗜血杆菌型特异性抗体，其种特异性为 100％，重复性好。试剂盒在 37℃可保存 7 d以上， 4℃可保存 10个月，－ 20℃可保存 1年以上。用两个诊断试剂盒检验 155份可疑病料、 2 191份血清， PCR的阳性率为 32.3％； A型抗体阳性率为 27.4％， C型抗体阳性率为 11.5％。

监测口蹄疫抗体的液相阻断ELISA法的改进和体会

液相阻断ELISA(LBE)法由于具有高度的敏感性、特异性和重复性,目前被广泛应用于动物免疫抗体效果监测实践工作中,特别是为防控牛、羊亚洲I型口蹄疫(FMD)做出了积极的贡献。但该方法操作繁琐,稍有不慎就会导致实验结果发生偏差或试验失败,笔者就该方法应用于亚I型口蹄疫抗体检测中的改进和体会作一总结。