阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究 :通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌ThermoanaerobacterethanolicusJW2 0 0克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因 ,与组氨酸标签融合 ,以高拷贝质粒pAlter Ex1在大肠杆菌中得到高效表达 ;基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,75℃的半衰期为 1h ;β 木糖苷酶在pH 5 .0～ 8.2之间有较高的稳定性 ,酶 1h半衰期温度为 84℃。

槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷胁迫对木麻黄小枝和根系渗透调节物质的影响

苗期是木麻黄（Casuarina equisetifolia L.）生长对化感胁迫比较敏感的时期,而渗透调节是植物适应逆境胁迫的重要生理机制之一.为明晰木麻黄应对化感胁迫的抗性机理,以＂惠安1号＂木麻黄水培幼苗为实验材料,在人为控制环境条件下,研究了在木麻黄化感物质槲皮黄素-3-α-阿拉伯糖苷（Q3A）0（CK）,12.5,25,50,100,200,400mg/L质量浓度模拟胁迫下,木麻黄幼苗根系及小枝渗透调节物质0~72h的变化规律及其生理调节机制.研究结果表明：200和400mg/L质量浓度化感物质胁迫下,木麻黄幼苗小枝的有机渗透调节物质可溶性蛋白、可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量均呈现先上升后下降趋势;其余胁迫处理的有机渗透调节物质均呈现上升趋势,而且胁迫质量浓度越高,有机渗透调节物质含量上升幅度越大;根系与小枝表现类似,但小枝的渗透调节能力优于根系.低质量浓度（12.5和25mg/L）化感物质胁迫结束后72h,小枝和根系的有机渗透调节物质含量可以恢复到对照水平.100,200,400mg/L质量浓度化感物质胁迫造成无机离子显著下降.其他不同程度的化感物质胁迫后,小枝和根系中的无机离子K＋、Mg2＋、Ca2＋等含量轻微下降或变化不大.上述研究结果表明：木麻黄幼苗在经受低质量浓度和短期化感物质胁迫下能够有效地进行渗透调节,而且有机渗透调节物质对化感物质胁迫的反应较无机离子更为敏感.本研究结果可为筛选抗自毒木麻黄无性系提供实验依据.

假密环菌cDNA文库的构建及其阿拉伯糖苷酶基因的克隆(英文)

用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的假密环菌的表达型cDNA文库。文库滴度为1.0×106pfu/ml,重组率约为98.3%,扩增后滴度为3.1×1 08pfu/ml,容量约为4.2×1010。从文库中随机挑选176个克隆进行5’端测序,得到147条表达序列标签(EST),并将测序结果提交到EMBL数据库。随机测序结果表明:插入片段长度均在200-800之间。测序结果经过生物信息学分析,发现有43 条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。用SMART-RACE技术成功获得了AJ620046的全长cDNA,克隆了AJ620046的开放阅读框AF,并成功构建了重组质粒pHIL-S1-AF,在毕赤酵母菌中进行了初步表达。

极耐热性阿拉伯糖苷酶在木糖制备中的应用

阿拉伯糖苷酶作为木聚糖降解的限速酶之一,在植物残体的生物转化、食品加工、饲料工业以及纸浆漂白中具有广泛的应用潜力。实验中选择pET—28a作为表达载体,优化核糖体结合位点RBS与起始密码子ATG间距离,使来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热性阿拉伯糖苷酶得到高效表达,重组酶蛋白经一步热处理后纯度达到90%以上;木聚糖酶解试验结果表明,阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶间存在协同作用;阿拉伯糖苷酶与木聚糖酶和β-木糖苷酶联合水解木聚糖能明显提高酶解产物中木糖含量,因此,开发极耐热性阿拉伯糖苷酶在酶法制备木糖中的应用具有重要的经济效益和社会效益。

新的田野甾醇阿拉伯糖苷

从海南省三亚附近海域采集的一种豆荚软珊瑚Lobophytumsp .样品中单离出一个新的甾体苷 1和 7个已知的化合物 2 - 8。通过波谱方法鉴定出它们分别是 3_O_β_D_阿拉伯吡喃糖苷_2 4(S)_2 4_甲基胆甾醇 (1) ,2 4(S)_2 4_甲基胆甾_4_烯_3β ,6 β_二醇 (2 ) ,Δ4(5) (E)_鞘氨醇_正十六碳酰胺 (3) ,柳珊瑚甾醇 (4 ) ,2 4_亚甲基胆甾醇 (5 ) ,鲨肝醇 (6 ) ,胸腺嘧啶 (7)和尿嘧啶 (8) ,其中化合物

热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化

α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶对来源于被子植物的木聚糖类半纤维素的生物降解和转化是必不可少的。文中首次报道了国内对该酶的研究。α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因工程菌在发酵罐中以LB为基质进行生长 ,以乳糖为诱导剂 ,所产生的α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶在 70℃热处理 3 0min后、经DEAE Sephacel阴离子柱层析、金属Ni2 + 的亲和层析等提纯步骤 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 49 3倍 ,收率为 2 0 4%。SDS PAGE法测定α 阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的分子质量为 85ku 。

哒嗪酮类阿拉伯糖苷化合物的合成与表征

1-Substituent-6-oxo-pyridazinone-tri-aceto glucosides arabinofuranoside and 1-substituent-6-oxo-benzopyridazinone-tri-aceto glucosides arabinofuranoside compounds were synthesized by one step reaction for the first time,The yields were 68%-83% and their structures were characterized by 1HNMR,IR and elemental analysis.

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因 ,以pET 2 0b为表达质粒 ,与其C末端 6个组氨酸标签序列融合 ,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为 90～ 95℃和pH 5 .0～ 5 .5 ,在pH 4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,95℃的半衰期为 4h ;SDS PAGE测得酶的分子量为 5 6 .5 7kD ,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中 ,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯 阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)有专一性水解作用 ,其动力学参数Km 值为 0 18mmol L ,Vmax为 139μmol min·mg。

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.

银盐法合成9-O-芴基-β-L-阿拉伯糖苷与表征

以自制的1-溴-2,3,4-三-O-乙酰基-L-阿拉伯糖和9-羟基芴为原料,在碳酸银的催化作用下,通过Koen igs-Knorr反应合成了2,3,4-三-O-乙酰基-9-O-芴基-β-L-阿拉伯糖苷化合物(Ⅰ),然后经无水碳酸钾脱去保护基得到9-O-芴基-β-L-阿拉伯糖苷(Ⅱ),它们的结构经NMR和元素分析所确认。

9-O-芴基-β-L-阿拉伯糖苷的合成与表征

在四丁基溴化化铵相转移催化剂的作用下,以二氯甲烷为溶剂,自制的1-溴-2,3,4-三-O-乙酰基-L-阿拉伯糖、9-羟基芴和无水碳酸钾为原料,合成了2,3,4-三-O-乙酰基-9-O-芴基-β-L-阿拉伯糖苷化合物,然后经无水碳酸钾脱去保护基得到标题化合物,总收率达63.9%。

重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列(Accession Number AJ620046)设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在 6．0～8．0之间,而在pH4．0～8．0范围内酶活基本保持在80％以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了良好的基础。

阿拉伯糖苷类药物的合成研究进展

阿拉伯糖苷类药物是一类非常重要的糖苷类抗肿瘤抗病毒药物。本文根据该类药物的化学结构特点,归纳了不同的合成策略,并对其合成方法进行了综述。

阿拉伯糖苷酶的研究进展

半纤维素是一类取之不尽而又亟待开发利用的碳水化合物。阿拉伯糖苷酶是降解从而利用半纤维素的一个重要酶 ,有关阿拉伯糖苷酶及其基因的研究在国际上得到了广泛而深入的开展。主要就阿拉伯糖苷酶的分类、特性、基因克隆表达及其应用作一综述。

菌株Chitinophaga sp.CH-1阿拉伯糖苷酶Ara1805基因克隆与表达

阿拉伯糖苷酶协同木聚糖酶在低聚木糖的生产、废物的生物处理、食品或饲料养分的提高以及半纤维素的生物转化等方面起着非常重要的作用。噬几丁质细菌是可以滑动并形成粘孢子的革兰氏阴性细菌,因具有较强的几丁质酶活性而得名。采用PCR方法从噬几丁质菌株Chitinophagasp.CH-1基因组DNA中克隆出编码阿拉伯糖苷酶基因ara1805,以pET29a为表达质粒,与其C末端6个组氨酸标签序列融合,在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。SDS-PAGE测得酶的分子量为38 ku,与理论推算值相吻合。表达菌株粗酶经检测表现出α-L-阿拉伯糖苷水解酶活性。蛋白质序列分析和其他来源的阿拉伯糖苷水解酶表明Ara1805中可能存在的活性中心为Asp67,Glu186和Asp236,说明该蛋白确实可能具有阿拉伯糖苷酶功能。研究为今后理性设计阿拉伯糖苷水解酶以期提高其水解活性奠定了一定的理论基础。

车前子壳诱导木聚糖酶与阿拉伯糖苷酶协同制备

该研究以车前子壳为诱导底物,采用单因素试验和响应面试验对里氏木霉(Trichoderma reesei)诱导木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的协同制备条件进行优化。单因素试验结果表明,在诱导碳源为车前子壳,初始pH为5.0、底物质量浓度为20 g/L、培养时间为4.0 d、碳氮比为1.6∶1.0时,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力最高,分别为(10.59±0.33)IU/mL和(8.99±0.05)IU/mL。响应面试验结果表明,最佳产酶条件为培养时间4.0 d、底物质量浓度20 g/L、碳氮比1.6∶1.0。在此最佳条件下,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分别为(11.42±0.15)IU/mL和(10.83±0.08)IU/mL,分别是未优化前的2.55倍和7.37倍。

HPLC同时测定鹿衔草提取物中香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素的含量

目的:建立HPLC同时测定鹿衔草提取物中香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素的含量。方法:色谱柱:Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱,流动相:乙腈-0.1%醋酸水,梯度洗脱;柱温:35℃,流速:1.0 ml·min^-1,检测波长:255 nm。结果:香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素分别在3.71~148.40μg·ml^-1(r=0.999 9)、5.92~236.70μg·ml^-1(r=0.999 8)、3.36~134.25μg·ml^-1(r=0.999 8)、3.94~157.80μg·ml^-1(r=0.999 9)和3.10~124.15μg·ml^-1(r=0.999 8)范围内线性关系良好,平均回收率分别为99.01%、98.80%、98.48%、98.71%和98.62%,RSD分别为0.95%、1.15%、1.36%、0.94%和1.02%(n=6)。结论:该方法快捷简便、准确性及重复性均良好,可用于鹿衔草提取物及相关制剂质量的评价和控制。

无溶剂、无催化剂条件下α-腺嘌呤阿拉伯糖苷的合成

为了发展有效合成α-腺嘌呤阿拉伯糖苷的方法,以1,2,3,5-四-O-乙酰基-β-D-阿拉伯糖和6-氯嘌呤为原料,在微波辐射和无溶剂、无催化剂条件下反应得到中间体9-α-D-(2',3',5'-三-O-乙酰基)阿拉伯呋喃糖基-6-氯嘌呤,收率85%。该中间体物在Na2CO3催化下脱除乙酰基,然后"一锅"加入饱和的NH3/CH3OH溶液氨解,以90%的收率得到α-腺嘌呤阿拉伯糖苷。关键中间体9-α-D-(2',3',5'-三-O-乙酰基)阿拉伯呋喃糖基-6-氯嘌呤的合成反应规模可以扩大到100 g。类似地合成α-2-氟腺嘌呤阿拉伯糖苷和α-2-氨基腺嘌呤阿拉伯糖苷。

HPLC测定黑骨藤中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷含量

目的:建立黑骨藤中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含测定方法。方法:采用反相高效液相色谱法,HypersilC18(4.6 mm×250 mm,5μm)柱,甲醇-水(33∶67)为流动相,流速为1 mL.min-1,检测波长370 nm,柱温25℃。结果:槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷在0.2044～2.044μg线性关系良好,r=0.999 9,平均回收率为97.78%,RSD 0.8%(n=9)。黑骨藤药材中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的平均含量0.19%。结论:该方法分离效果好,简便准确,可用于黑骨藤中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量测定,以控制黑骨藤药材质量。

微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究进展

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Alpha-L-arabinofuranosidase,α-L-AFase)属于糖苷水解酶类,主要功能是水解阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖取代基,并与其他水解酶协同促进半纤维素的降解,从而改善半纤维素的生物转化率。本文综述了近年来微生物来源α-L-AFase的酶学特性、性质改良、结构、催化机制和协同作用效应等方面的研究进展,发现不同微生物来源的α-L-AFase的理化性质、分子结构和催化机制均存在着多样性,重组表达的方法能有效改善α-L-AFase的活性和稳定性,且α-L-AFase与其他半纤维素水解酶的协同催化作用使底物的转化效率显著提高。α-L-AFase广泛应用于改善面团发酵质地、果汁澄清、酿酒工艺优化、制备高消化率饲料以及功能性保健产品研制等多个领域。本文为后续α-L-AFase的基础研究、开发和利用提供一定的参考。