阿维链霉菌中ECF-Sig25的调控通路

ECF-Sigma因子和双组份调控系统连锁调控在细菌适应不同的生存环境和压力条件中起着重要作用。为研究阿维链霉菌中的ECF-sig25基因,通过孢子点接试验检测Sig25对胁迫的响应,通过平板划线分析其对形态分化的影响,通过生物信息学、RT-qPCR等验证Sig25的靶基因,以探索Sig25的调控通路。结果显示,ECF-sig25基因上游存在1个双组份调控系统基因smrAB;且上游调控元件SmrA的磷酸化严格依赖于SmrB。压力胁迫试验显示,Sig25响应碱、渗透压、去污剂和热激胁迫,不响应氧化、酸和EDTA胁迫。生物信息学预测、RT-qPCR和EMSA(electrophoretic mobility shift assay)揭示,Sig25直接调控whiG、SAV3434、SAV4621、SAV5010、SAV6537、SAV7165、gdhA1、glnA2和amtB1基因的转录,这些基因分别参与形态分化、甲基供给、DNA复制、信号传导、次级代谢和氮代谢等生理过程。平板划线结果显示,缺失sig25不影响阿维链霉菌的形态分化。

阿维链霉菌高产菌株的复合筛选

目的筛选阿维链霉菌高产菌株。方法采用ARTP诱变和aveR基因过表达2种选育方式对阿维链霉菌进行复合筛选。结果经ARTP诱变筛选出RW-51诱变菌株效价为7268 U/mL,高于原始菌株8.9%。再结合aveR基因过表达菌株的构建,筛选出高产菌株RW-997初筛效价7649 U/mL,高于RW-51诱变菌株7.7%,高于原始菌株14.6%。结论筛选出1株高产菌株RW-997,用于大生产。

阿维链霉菌中ECF-Sig16对阿维菌素合成的影响

阿维菌素是阿维链霉菌产生的一种广谱、高效、低毒的杀虫抗生素,在医药、农业和畜牧业领域有着广泛的应用。ECF-Sigma因子在细菌适应生存环境变化和高效响应激活压力中起重要作用。为研究阿维链霉菌中ECF-Sig16因子对阿维菌素合成的影响,通过对sig16基因缺失、回补和过表达,利用摇瓶发酵试验初步证实Sig16能够抑制阿维菌素的合成,但不影响菌株的生长。表型观察试验显示Sig16不影响阿维链霉菌的形态分化。通过凝胶阻滞试验(EMSA)确定Sig16直接结合在支链氨基酸ABC转运体操纵子SAV1190~SAV1194的启动子区,暗示Sig16可能通过影响阿维菌素生物合成的前体物质,抑制阿维菌素的合成。

阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响

利用用于基因破坏的重组质粒pCZ2 (pKC1 1 39∷ 475bpaveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76- 9的aveD基因进行插入失活 ,将获得的aveD破坏子进行摇瓶发酵和阿维菌素初步提取和HPLC检测 ,发现破坏子仅产生四个主要组分 ,但它们的保留时间分别比Bla、Blb、B2a和B2b的略长。进而将粗提液纯化并获得晶体 ,以UV、IR、NMR ( 1H NMR和13C NMR)和MS进行结构分析 ,并结合HPLC检验 ,证明它们属于C5 氧 阿维菌素B。说明阿维链霉菌的aveD基因破坏 ,不仅丧失了合成阿维菌素A组分的能力 ,也造成了其下游的aveF基因不能表达 ,因此只产生了C5 氧 阿维菌素B。

阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1 1 3 9∷△aveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76 9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测 ,发现该突变株只产生阿维菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失 ,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同 ,突变株中B1的产量略有提高 。

阿维链霉菌bkdAB的基因中断对阿维菌素合成的影响

以阿维菌B组分菌株StreptomycesavermitilisBjbm0 0 0 6为出发菌株 ,用PCR的方法构建bkdAB基因簇(Branched_chainα_ketoaciddehydrogenasegeneAB)的基因置换质粒pHJ582 1(pHZ13 58∷bkdAB&erm) ,并对其进行基因中断 ,得到重组菌株Bjbm582 1。Bjbm582 1的发酵产物经HPLC检测发现 ,除了产生B1a和B2a外 ,还产生一种原菌株没有的新组分 ,3个组分的总含量只有出发菌株Bjbm0 0 0 6的 2 5%。结果表明bkdAB的中断不仅部分阻断了阿维菌素的合成 ,还阻断了阿维菌素b组分的合成 ,可以推测bkdAB的产物在阿维菌素合成途径中主要承担了α酮基异戊酸脱氢酶 (α_ketoisovalericaciddehydrogenase)

基于GC-MS的阿维链霉菌代谢物组学研究方法的建立

基于GC-MS分析平台,建立了阿维链霉菌代谢物组样品制备过程中的菌体分离、细胞清洗、细胞淬灭及代谢物提取条件,并对阿维菌素高产菌株和野生菌株胞内代谢物组进行了初步分析。采用"冷冻离心-细胞清洗(3次)-液氮淬灭(5min)-珠磨破壁(3个循环,每个循环48 s)-提取(氯仿∶乙醇∶水=2∶2∶1)"的方法,可以定性和定量检测阿维链霉菌胞内包括氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类等59种差异化合物。建立的方法能够有效地用于阿维链霉菌胞内代谢物的分析。

透明颤菌血红蛋白基因在阿维链霉菌中的表达

将含有自身启动子的透明颤菌血红蛋白基因（ ｖｈｂ） 克隆至大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体ｐＩＪ６５３ 中构建成表达载体ｐ ＷＹ１０１ 和ｐ ＷＹ１０２ ，用它们转化阿维菌素（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎｓ） 产生菌———阿维链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ） ，经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析并未检测到ｖｈｂ 基因表达，但用穿梭载体ｐＨＺ１２５２（ 其中的ｖｈｂ 基因位于受硫链丝菌素诱导的链霉菌强启动子ＰｔｉｐＡ之下） 转化阿维链霉菌并经硫链丝菌素诱导，则在该菌中表达出了有活性的ＶＨｂ 蛋白。ｐＨＺ１２５２ 在阿维链霉菌中发生了重组缺失，但缺失的ｐＨＺ１２５２ 上仍含有完整的ｖｈｂ 基因及诱导型强启动子，且可在阿维链霉菌中稳定遗传，却不能再转化大肠杆菌。

响应面法优化阿维链霉菌生产多拉菌素的培养基（英文）

运用统计试验设计和分析方法优化阿维链霉菌XJ-8-115产多拉菌素的最佳发酵培养基。利用Plackett-Burman设计法(PBD)评价了8种原料组分对多拉菌素生产的影响,再采用最陡爬坡法确定培养基组成的最佳区域,最后以3因素5水平的中心组合设计(CCD)为基础,利用响应面法(RSM)获得多拉菌素最大发酵产量的培养基最佳配比。结果表明:8种原料组分中,干酵母粉、MgSO4和NH4Cl对结果有极显著影响。响应面试验得到到最佳培养基为:75g玉米淀粉,18g干酵母粉,1.35gKCl,0.16gMgSO4,1.8gK2HPO4·3H2O,0.012gFeSO4·7H2O,0.045gNa2Mo4·2H2O,0.09gNH4Cl,0.005gCoCl2·6H2O和2gCaCO3。通过该培养基发酵获得的最大多拉菌素产量为103.54g/mL,与原培养基相比,产量提高了1.80倍,为36.93g/mL,与RSM预测值差异仅为2.22%。

阿维链霉菌bkdF的基因中断对阿维菌素合成的影响

以阿维菌素B组分菌株StreptomycesavermitilisBjbm0 0 0 6为出发菌株 ,用PCR方法构建支链α 酮酸脱氢酶基因bkdF(Branched chainα ketoaciddehydrogenasegene)的重组质粒pHJ5 816 (pHZ135 8 bkdF&Ermr)对其进行基因中断 ,得到重组菌株Bjbm5 816。经HPLC检测和核磁共振分析发现 ,Bjbm5 816发酵产物产生的单一组分新化合物为Oligo mycinA。

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在阿维链霉菌的整合表达

pHZ1276是透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的诱导型表达载体,携带有硫链丝菌素诱导的强启动子PtipA和ФC31int,attP基因使载体整合在染色体上。本研究利用组成型启动子ermP1P2替代pHZ1276上的诱导型启动子PtipA构建了组成型表达血红蛋白基因的质粒pHZ1291。将vgb基因去掉后构建了组成型链霉菌表达载体pHZ1294。将pHZ1276,pHZ1291导入阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)NRRL8165,所得重组子经Southern杂交验证后,蛋白粗提物经Western杂交和CO结合实验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。

^(60)Coγ射线辐照选育阿维链霉菌及辐射效应研究

[目的]采用60Coγ射线辐照选育阿维链霉菌,筛选B1a产量提高的突变菌株。[方法]用60Coγ射线作为诱变源,在辐照剂量200～1 600 Gy、剂量率10 Gy/min的条件下对一株未经任何诱变的微生物农药阿维菌素菌株Av2进行了诱变改良;对该菌株的致死率、突变率、菌落形态变化与60Coγ射线辐照剂量的关系进行了探讨,其中初筛采用抑菌圈法,复筛采用摇瓶培养发酵,阿维菌素含量测定采用高效液相色谱法。[结果]在800 Gy辐射剂量下得到了Av2-m212、Av2-m245和Av2-m286 3株高效突变菌,其Bla产量分别比原始菌株提高了36%、41%和46%,均属于皱缩型菌株。高于30%的正突变菌均在800 Gy辐射剂量下产生,该剂量点是致死率和正突变率趋于平稳的交叉点。辐照后皱缩型和火山型突变菌有正突变菌,其他形态菌株均为负突变。[结论]60Coγ射线在阿维菌素产生菌的诱变筛选中起到了重要作用,是一种非常有效的微生物诱变育种方法。

阿维链霉菌发酵培养基的优化

通过优化发酵过程中培养基的组成使得阿维链霉菌的发酵单位及有效组分Bla含量提高。采用单因子试验法及均匀设计试验法分析各种营养成分及其配比对阿维链霉菌Co39-15发酵单位和有效组分Bla含量的影响。获得最佳的种子培养基和发酵培养基配方,发酵单位及有效组分Bla含量比原来的发酵水平分别提高了20%～30%、8%～10%。利用单因子试验法及均匀设计试验法对抗生素的发酵培养基进行优化,是一种快速、效果显著的方法。

阿维链霉菌双组分信号系统的生物信息学分析

应用多种生物信息学方法,如序列比对、多序列比对、系统进化树分析、二级结构预测等,对阿维链霉菌中双组分信号系统蛋白进行鉴定分析。结果表明:阿维链霉菌中存在61个组氨酸蛋白激酶,其中30个组氨酸蛋白激酶包含了全部的保守传递器结构域。阿维链霉菌中也存在69个应答调控蛋白,主要分布在3种主要的应答调控蛋白家族中。与天蓝色链霉菌和其他微生物中双组分信号系统进行比较和对功能结构域进行分析,表明:在这些蛋白所组成48个双组分信号系统中,多个双信号调控系统与阿维链霉菌中环境刺激反应和调控相关。

产高纯度阿维菌素B组分的阿维链霉菌突变株

对某生产菌株MA-1进行诱变的过程中筛选得到一株新菌株MA-2,通过TLC和HPLC分析,确认其发酵产生的活性成分只有B组分,包括B1a和B2a两种主要成分,以及微量B1b成分。经多次菌株传代培养,表明这一组分组成的稳定性良好。

阿维链霉菌原生质体制备方法的研究

对阿维链霉菌原生质体制备进行了研究,结果表明:阿维链霉菌原生质体制备的最佳条件为在35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培养基中接种孢子悬液,28℃、200 r/min培养40 h;3 000 r/min收集菌丝体,用10.3%蔗糖溶液清洗2次;溶菌酶浓度为4mg/mL的P缓冲液悬浮菌丝体,30℃下处理50 min完成原生质体制备。以50%PEG1000为促融剂,原生质体融合率最高。

阿维链霉菌NRRL8165中bldA_a的克隆及其对形态分化与阿维菌素合成的影响

bldA编码天蓝色链霉菌中唯一有效识别UUA亮氨酸密码的tRNA(Leu)UUA。通过构建阿维链霉菌NRRL8165基因组亚文库,筛选得到含有阿维链霉菌bldAa及其侧翼序列的克隆。利用λRED介导的PCRtargeting技术构建了bldAa的基因置换质粒pHL358,将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,筛选得到bldAa基因置换菌株TW10。TW10表现为光秃表型,表明bldAa调控阿维链霉菌的形态分化。摇瓶发酵TW10菌株并对发酵产物进行HPLC分析,发现TW10菌株均不合成阿维菌素组分,提示阿维菌素的合成受bldAa调控;考察阿维菌素生物合成基因簇,其中aveA3和aveR含有TTA密码,它们的翻译可能受bldAa调控,与实验结果一致。

阿维链霉菌中转录因子AveR对阿维菌素生物合成的正调节

aveR是阿维链霉菌NRRL 8165阿维菌素生物合成基因簇中唯一可能的调节基因.为了验证aveR是否参与阿维菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于敲除aveR的基因置换质粒pJTU2530,并通过接合转移引入了阿维链霉菌.通过筛选ThioSAprR转化子,经聚合酶链式反应(PCR)扩增验证,获得了aveR内部1 320 bp区域被阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV替换的突变株ZD10.高压液相色谱检测表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10不再产生阿维菌素,并且ZD10中寡霉素的产量明显高于野生型菌株.进一步的反转录PCR(RT-PCR)分析表明,与野生型菌株相比,突变株ZD10的聚酮合酶基因aveA3不再转录.结果显示,AveR是阿维菌素生物合成的正调节因子,通过调节结构基因的转录表达来影响阿维菌素的产生.

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。

阿维链霉菌孢子色素生物合成对阿维菌素产量的影响

以野生型阿维链霉菌NRRL8165为出发菌株,用PCR方法克隆孢子色素基因簇直系同源基因(whiEa)侧翼片段,并构建基因置换载体pHL643。将pHL643跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,通过置换载体和染色体之间的同源双交换,对染色体上的whiEa基因簇进行置换,得到3株阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌素敏感的重组菌株,均表现为孢子色素合成缺陷。通过Southern杂交分析,证明whiEa基因簇被置换。通过摇瓶发酵和HPLC检测,发现whiEa基因簇置换菌株所产阿维菌素产量明显提高,表明孢子色素与阿维菌素生物合成之间可能有竞争底物的现象。