霍乱毒素B亚基基因具有自己的启动子

本研究发现并证实霍乱毒素Ｂ亚基基因上游ＸｂａＩ～ＣｌａＩ限制性片段内存在具有启动子活性的序列；在该启动子作用下，霍乱毒素Ｂ亚基表达水平可达２００ｍｇ／Ｌ，氯霉素乙酰基转移酶基因表达水平随培养条件不同在０．３～１０ｍｇ／Ｌ之间，大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的表达量达４１００单位／ｍｌ。在该启动子的控制下霍乱毒素Ｂ亚基基因可以高效表达，该启动子的存在可能是霍乱毒素操纵子中霍乱毒素Ｂ亚基表达量是Ａ亚基的６倍的原因。

STAg和霍乱毒素不同程序滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫作用

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)和霍乱毒素(cholera toxin,CT)佐剂不同程序滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染能力,确定STAg和CT滴鼻免疫的最佳程序。方法BALB/c小鼠随机分为3组:1次、2次和3次免疫组,用20 μg STAg+1 μg CT/只分别滴鼻免疫1次,2次或3次,前2次间隔2周,末次间隔1周。末次免疫后第14天,用4×104个速殖子/只灌胃攻击所有小鼠,观察小鼠健康及死亡情况,攻击后第30天处死,ELISA法检测血清IgG和粪便IgA,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数派伊尔结(Peyer′spatches,PP)和脾淋巴细胞数。结果2次和3次免疫组小鼠存活率明显高于1次免疫组(P<0.05),肝、脑组织内虫荷显著低于1次免疫组(P<0.001),血清IgG和粪便IgA高于1次免疫组,PP和脾淋巴细胞数无显著性变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫2次或3次能有效诱导小鼠抗弓形虫感染。

霍乱毒素B亚单位的研究进展

目的 介绍霍乱毒素B亚单位最新研究进展。方法 从霍乱毒素B亚单位的基因表达、作为载体蛋白与免疫佐剂的应用、与免疫原的不同使用方法和不同的免疫途径对其免疫佐剂作用的影响等方面进行介绍。结果 霍乱毒素B亚单位是有较好应用前景的载体蛋白 ,具有较强的佐剂活性 ,可以增强细菌、病毒以及其他抗原的免疫原性。

变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因转基因黄瓜植株的获得及鉴定

目的:经农杆菌介导将变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因导入黄瓜,获得转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的研究提供实验基础。方法:利用双元载体pCAMBIA2301构建变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合质粒(PAcA-ctxB)的植物表达载体p2355-PAcA-CTB;电转化法导入农杆菌EHA105;采用叶盘转化法转化黄瓜,转基因植物经过卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测目的基因鉴定。结果:成功得到转基因黄瓜植株,卡那霉素抗性筛选、GUS基因染色、PCR及Southern blot杂交分析检测证实目的基因PAcA-ctxB已整合至黄瓜基因组中。结论:获得了含有变异链球菌表面蛋白A区与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的转基因黄瓜植株,为转基因可食防龋疫苗的进一步研究提供了实验基础。

弓形虫抗原与霍乱毒素A2/B亚基复合基因在小鼠体内诱导的免疫反应

目的 观察弓形虫主要表面抗原SAG1、SAG2 与霍乱毒素A2 /B亚基复合基因真核质粒经肌肉免疫小鼠所诱导的免疫反应。方法 将SAG1基因、SAG2 基因及CTXA2 /B基因定向连接插入真核表达质粒pcDNA3.1,经酶切及测序,获得pcDNA3.1 SAG1 SAG2 及pcDNA3.1 SAG1 SAG2 CTXA2 /B的重组子;碱裂解法大量制备经肌肉注射免疫BALB/c鼠,每只鼠经后腿肌肉注射质粒10 0 μg ,每2周免疫1次,共3次,以PcDNA3.1空质粒注射组及PBS组为对照,分别于每次免疫前断尾取血和免疫后4周取小鼠脾脏测定T淋巴细胞增殖活性及NK细胞活性,ELISA法测定IgG抗体。结果 免疫组小鼠的IgG抗体水平明显提高,NK细胞杀伤活性和T细胞增殖活性也明显增强。免疫鼠抗攻击感染的时间延长。结论 含有霍乱毒素的复合基因免疫小鼠后体液免疫和细胞免疫水平均有提高。

霍乱毒素A基因内部翻译调控元件具有翻译起始功能

通过大肠杆菌体外转录－体外翻译系统，证明霍乱毒素A基因内部的翻译调控元件具有翻译起始功能，且其翻译起始效率较ctxA基因高得多．当ctxA的起始密码突变时，从该元件起始的翻译效率下降，说明基因内翻译起始效率受ctxA翻译起始的调控。结果进一步证实了霍乱毒素A、B亚基比例表达调控的翻译弱化－翻译偶联机理。

霍乱毒素B亚单位对树突状细胞成熟的影响

背景:已有实验证明,霍乱毒素可诱导树突状细胞成熟。霍乱毒素B为霍乱毒素的无毒亚单位,是一种良好的免疫佐剂和输送抗原载体,其是否能促进树突状细胞成熟至今尚未得到证实。目的:观察树突状细胞2.4的表型和功能变化,初步探讨霍乱毒素B对树突状细胞成熟的影响。方法:通过细胞培养增殖树突状细胞2.4。将树突状细胞分成5组:空白对照组:不进行任何处理;霍乱毒素B0.1,1.0,10mg/L组:分别在培养液中加入相应霍乱毒素B;阳性对照组:培养液中加入脂多糖,终浓度1mg/L。每组设6复孔。采用流式细胞术检测培养不同时间树突状细胞2.4细胞表面CD80,CD86,MHC-Ⅱ类分子的表达,并行体外混合淋巴细胞反应,MTT法观察树突状细胞对同种T细胞的刺激能力。结果与结论:10mg/L霍乱毒素B显著增强树突状细胞表面分子(CD80,CD86和MHC-Ⅱ)的表达(P<0.01),并显著提高树突状细胞对T细胞的激活能力(P<0.01)。阳性对照组与空白组之间差异有显著性意义(P<0.01)。结果显示霍乱毒素B能增强树突状细胞的活化与成熟,对其免疫学功能起正性调节作用。

弓形虫可溶性速殖子抗原和霍乱毒素滴鼻免疫小鼠诱导的鼻通道细胞免疫应答

目的研究弓形虫可溶性速殖子抗原(solubletachyzoiteantigen,STAg)和霍乱毒素(choleratoxin,CT)佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后鼻通道(nasalcavity,NC)的免疫效应及持续时间。方法BALB/c小鼠96只随机分为实验组和对照组,实验组以STAg(20!g/只)为抗原,CT(1!g/只)为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS滴鼻。滴鼻2次(间隔2周)后分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死6只小鼠。分离NC的淋巴细胞,计数并涂片,用免疫细胞化学法检测其CD4+T、CD8+T细胞亚群水平。结果小鼠免疫后,NC淋巴细胞第1周至第10周持续显著增生(P<0.05);NC中CD4+T细胞水平第1周至第8周持续显著增高(P<0.05),CD8+T细胞在第1、2、3周(P<0.05)显著增高,持续至免疫后第3周,CD4+/CD8+比值无明显变化。结论STAg和CT佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可有效诱导NC的免疫应答,并可持续较长时间。

不携带霍乱毒素基因的CTXΦ类前噬菌体基因组克隆与分析

霍乱弧菌的霍乱毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌体CTXΦ编码 ,由此携带毒素基因在产毒株与非产毒株间水平转移。从无ctxAB的ElTor型菌株中 ,发现不同时间、地点来源的部分菌株仍带有CTXΦ基因组的其它基因 ,在研究菌株染色体上呈双拷贝串联排列。克隆后测序发现基因组全长 5 70 8bp ,其抑制基因rstR却与古典型菌株来源CTXΦ的相同 ,因此从E1Tor菌株中发现整合有古典型来源的这类噬菌体。其它各基因与CTXΦ序列基本一致 ,但nct CTXΦ的zot基因末端及下游间隔区与CTXΦ的相差很大 ,进一步的序列测定与比较表明nct CTXΦ中无ctxAB应是其固有结构 ,而不是ctxAB丢失所形成的。将这种独特的前噬菌体命名为nct CTXclassΦ。研究菌株染色体上nct CTXΦ基因组上下游也各存在TLC因子和RTX毒力基因簇的同源序列 ,揭示它们与nct CTXΦ基因组有与CTXΦ相同的联系。从序列分析上认为nct CTXΦ与CTXΦ在遗传分化上有不同 ,可能是CTXΦ的前体形式 ,这对CTXΦ的来源。

霍乱毒素B亚单位基因的克隆及其核苷酸序列分析

利用 PCR技术从含有霍乱毒素 B亚单位 ( CTB)基因的质粒 p UCT1中扩增出不包括信号肽的 3 0 9bp的 CTB全基因 ,并通过点突变技术消除了 CTB阅读框内的终止密码子 ( TAA→GAA) ,以便于在 CTB基因的下游融合其他的外源基因。用限制性内切酶 Bam H 和 Eco R 对 PCR产物进行双酶切 ,以 T4DNA连接酶将其定向连接于经同样酶切处理的质粒 p ET-2 8b( +)的多克隆位点上 ,构建成重组质粒 p ECTB,转化至BL2 1 ( DE3 )中。经 Bam H 和 Eco R 双酶切分析和 PCR扩增检测 ,证明重组质粒 p ECTB中含有 CTB基因。核苷酸序列分析表明 ,克隆的

纯化重组霍乱毒素B亚单位与天然霍乱毒素B亚单位性质的对比研究

霍乱毒素Ｂ亚单位（ＢＳ）已用于新型口服霍乱疫苗、佐剂及蛋白质载体，但成本高，来源困难．用重组霍乱毒素Ｂ亚单位（ｒＢＳ）代替ＢＳ可克服上述缺点．ｒＢＳ用于上述目的前必须证实其在物理、化学及免疫学性质方面与天然同类产品的一致性．用亲和层析法从各批次大罐发酵所获工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２（ｐＭＭ－ＣＴＢ）培养物上清中制备得到了小批量ｒＢＳ纯品，在同等条件下与ＢＳ（Ｓｉｇ－ｍａ公司产品）进行理化、免疫学性质的对比研究，证实二者在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中电泳带位置一致、分子量相同，纯度达９９％；在反相ＨＰＬＣ中出峰行为一致，纯度达１００％；在半干式聚焦电泳分析中电泳带分布相同，等电点为７．９１．ｒＢＳＮ端起的２０个氨基酸序列为ＴＰＱＮＩＴＤＬＣＡＥＹＨＮＴＱＩＨＴＬ，与克隆基因来源株的毒素Ｂ亚单位同一段序列完全一致．氨基酸组成分析证实ｒＢＳ与ＢＳ相近．在免疫学性质分析中，ｒＢＳ与ＢＳ在免疫双扩散试验中与抗ＣＴ均出一条沉淀线且相互吻合；在免疫电泳试验中二者与抗ＣＴ在相应位置上产生一条沉淀弧；二者均能与神经节苷脂ＧＭ１结合且这种结合均可通过二者与抗ＣＴ的预保温处理而被阻断．对比研究结果揭示ｒＢＳ与ＢＳ性质完全一致，可代替ＢＳ用于?

霍乱毒素对远端视神经损伤后视网膜节细胞再生的影响

目的 探讨霍乱毒素 (CTx)对成年金黄地鼠远端视神经受损后视网膜节细胞 (RGCs)再生的作用。方法 远端切断视神经并对接一段自体坐骨神经 (AG) ,玻璃体内注射CTx及 或植入小段坐骨神经分支 (SN)。动物随机分为对照组Ⅰ (AG组 )与对照组Ⅱ (溶剂组 ) ;AG +SN组 ;AG +CTx组 ;AG +SN +CTx组和量效关系组 ,前五组分别存活 4周～ 6周 ,用粒蓝逆行标记再生的RGCs ,荧光显微镜下观察。 结果 AG +CTx组各时间点再生的视网膜节细胞比对照组Ⅰ与对照组Ⅱ明显增加 ,具统计学意义 (P <0 0 5 ) ;AG +SN组得出相似结果。AG +SN +CTx组与其它几组相比在各时间点上均存在极显著性差异 (P <0 0 1)。 结论 霍乱毒素可明显提高远端视神经受损后视网膜节细胞的再生。

霍乱毒素对金黄地鼠视网膜节细胞再生的作用

目的 探讨霍乱毒素 (CTX)对金黄地鼠视网膜节细胞 (RGCs)再生的促进作用。 方法 成年金黄地鼠近端切断视神经 (ON )并缝接一段自体坐骨神经 (AG) ,玻璃体内注射 CTX 及 /或插入小段坐骨神经分支 (SN)。动物随机分为 AG组和溶剂组 ;AG+ CTX组 ;AG+ SN组 ;AG+ CTX+ SN组 ;量效关系组。前 4组动物存活 2～ 6周。用粒蓝逆行标记再生的 RGCs,在荧光镜下观察视网膜平铺片再生 RGCs的数量变化。 结果 AG+ CTX 组各时间点视网膜再生 RGCs平均数比 AG组和溶剂组增加 ,具有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;AG+ SN组也得出相似结果。AG+ CTX+ SN组各时间点的视网膜再生 RGCs平均数分别比 AG组和 AG+ SN组明显增加 (P<0 .0 1)。 结论 提示霍乱毒素或 /与坐骨神经具有显著促进视神经切断后视网膜节细胞再生的作用。

霍乱毒素佐剂的研究进展

霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,具有很强的免疫原性和佐剂活性,是当今研究得最多且最深入的粘膜免疫佐剂之一。CT本身有很强的毒副作用,而一定的毒性又似乎是发挥佐剂作用所必须的;通过各种改造,使之具备优良的佐剂活性而没有显著的毒副作用是当前研究的主要目标。本文从CT作为佐剂的作用机理出发,概述当前对其进行改造的几种研究方向。

宋内Ⅰ相O抗原及霍乱毒素B亚基在福氏2a痢疾菌中的表达及其免疫保护效果的观察

本文利用基因重组的方法，将宋内Ｉ相Ｏ抗原基因以及霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ｃｔｘ－Ｂ）克隆至带链球菌的ａｓｄ基因的表达载体，然后转化至ａｓｄ－痢疾菌苗株福氏２ａＴ３２。脂多糖银染以及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实以上两基因都能在宿主菌中稳定表达。动物（小白鼠）保护实验表明，该重组菌对福氏２ａ、宋内氏痢疾菌的保护效率达１００％，对霍乱弧菌的保护效率也达７０％。该菌具有稳定、无抗生素标记、多价的特点。

重组霍乱毒素B亚基与恶性疟原虫多抗原表位融合蛋白对恒河猴的免疫保护作用研究

使用重组霍乱毒素B亚基 (CTB)与恶性疟原虫抗原表位融合蛋白 (AWTE)免疫恒河猴 ,研究其免疫应答并观察对食蟹疟原虫攻击的保护作用。结果表明 :在 0 ,1 4 ,2 8天分别通过鼻腔和肌肉注射免疫恒河猴 ,第 3次免疫后2周 ,抗CTB抗体平均滴度可达 1∶5 1 2 (鼻腔免疫 )和 1∶1 0 0 0 0 (肌肉免疫 ) ;肌肉免疫后抗疟原虫抗体滴度也显著高于鼻腔免疫组。用 1 2 5× 1 0 8个食蟹疟子孢子攻击 ,对照组 5只恒河猴在攻击后 1 0～ 1 4d全部感染 ,其中 1只在攻击后 2 1d死亡 ,另 4只重度感染 ,感染持续 30d以上。鼻腔免疫组的 5只动物均在攻击 2 0d后出现原虫 ,其中 3只轻度感染 ,感染持续 4d后即恢复 ,其余 2只感染持续 36d以上。肌肉注射组 3只未受感染 ,其余 2只在攻击后 1 9d后轻度感染 ,感染 4d后即完全恢复。以上结果表明 ,使用霍乱毒素B亚基为载体蛋白构建的重组疟疾疫苗具有良好的免疫原性 。

丙型肝炎病毒抗原决定簇与霍乱毒素B亚基的融合表达以及融合蛋白的抗原性

通过固相化学合成法，合成了编码丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区和非结构区的４个抗原决定簇基因，这些抗原决定簇基因片段以不同方式串朕后与ｃｔｘＢ基因融合，构建了１２种表达不同嵌合蛋白的重组质粒。各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白，表达产量随所融合的抗原决定簇不同在１０～５０μｇ／ｍｌ之间，表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关，而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化达到了电泳纯。对１１种融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇的反应原性的研究表明，多数融合蛋白中ＨＣＶ抗原决定簇均能与对应的ＨＣＶ抗体结合。其中以融合蛋白９５０８２为抗原研制的抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂具有良好的灵敏度和特异性。

霍乱毒素对三氟氯氰菊酯抗性及敏感棉铃虫神经细胞L型钙通道的调节作用(英文)

霍乱毒素(CTX)可激活兴奋性异三聚体G蛋白(Gαs)的α_亚基和刺激电压门控L_型钙通道,而昆虫的L_型钙通道可能是拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶点。为进一步探讨农业害虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的作用机理,我们检测了CTX对三氟氯氰菊酯抗性及敏感棉铃虫Helicoverpaarmigera中枢神经细胞电压门控L_型钙通道的调节作用。分别急性分离三氟氯氰菊酯抗性及敏感的3～4龄棉铃虫幼虫胸腹神经节细胞,并在改良的L15培养基(加入或未加入700ngmL的CTX)中培养12～16h。钡离子为载流子,应用全细胞膜片钳技术记录电压门控L_型钙通道电流。结果显示,CTX可使敏感组棉铃虫神经细胞L_型钙通道的峰值电流密度增大36%、峰值电压左移5mV,但对抗性组棉铃虫神经细胞L_型钙通道无上述作用。并且,CTX对敏感组及抗性组棉铃虫神经细胞L_型钙通道的激活电位、翻转电位、激活曲线和失活曲线等其他一些参数的影响也不明显。在无CTX作用时,所检测到的抗性组与敏感组棉铃虫神经细胞L_型钙通道的上述参数值间差异不显著。结果提示,棉铃虫神经细胞内存在Gs腺苷酸环化酶(AC)cAMP蛋白激酶A(PKA)L_型钙通道信号调节系统;与敏感棉铃虫神经细胞L_型钙通道相比,三氟氯氰菊酯抗性棉铃虫神经细胞L_型钙通道的活性相对不易受到CTX调节,这可能与昆虫对拟除虫菊酯产生抗药性的机理有关。

不同直径胶体金结合霍乱毒素B亚单位的逆行轴浆转运及其应用

不同直径胶体金结合霍乱毒素Ｂ亚单位复合物（ＣＢ－Ａｕ）注射于大鼠不同部位，观察对神经元的标记效果。实验结果：（１）ＣＢ－Ａｕ较ＣＢ－ＨＲＰ注射靶区扩散范围小，经银加强后ＣＢ－Ａｕ呈黑色致密的圆颗粒。（２）肌肉注射以５ｎｍ和１０ｎｍＣＢ－Ａｕ对神经元的标记效果较好，１７ｎｍＣＢ－Ａｕ几乎难以标记神经元。在中枢神经系统，此三种直径ＣＢ－Ａｕ标记效果相似。（３）银加强标认神经元后可复合免疫细胞化学（ＩＣＣ）方法，双标记神经元的银颗粒与ＩＣＣ反应产物极易分辨；由此发现大鼠ｃａｌ－ｂｉｎｄｉｎ－Ｄ２８Ｋ阴性和阳性的红核脊髓投射神经元。（４）ＣＢ－Ａｕ滞留神经元内至少３５ｄ，故可行慢性实验。因此在比目鱼肌注射ＣＢ－Ａｕ的第５天切除该肌，３０ｄ后经银加强复合用ＣＧＲＰＩＣＣ仍能清晰分辨标认的神经元。结果表明，ＣＢ－Ａｕ为一很好的轴浆转运示踪剂尤适合复合ＩＣＣ的双标研究。

变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因在转基因番茄中的表达

目的:在获得含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学技术检测外源基因在转基因植株中的表达,测定目的蛋白的含量。方法:PCR筛选含编码变异链球菌表面蛋白PAcP与霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄植株;提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量;通过Western印迹检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。结果:PCR扩增分析可见1.6 kb特异性扩增条带,出现特异性条带的植株占总检测植株的55.6%;转基因番茄总蛋白含量为3.93 mg/mL,Western印迹结果显示,在PVDF膜上,约60 kD处出现特异性条带;ELISA测得表达的目的蛋白占番茄可溶性总蛋白的0.18%。结论:含编码变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。