caspase3在卵巢癌非凋亡进展过程中的治疗作用

卵巢癌由于缺乏特异性症状和体征,使其在确诊时多为晚期。近些年卵巢癌放化疗耐药性的出现导致患者的高死亡率。研究卵巢癌的非凋亡程序对于提高卵巢癌的存活率至关重要。caspase3在卵巢癌非凋亡调控中发挥着重要作用,是卵巢癌各种抗癌治疗过程中的主要介导因子,如细胞毒性药物、放疗、化疗及免疫治疗等。探索caspase3介导的非凋亡程序在卵巢癌治疗中的作用和价值对于提高患者的存活率有着重要作用。本文综述了近年来caspase3在卵巢癌治疗中的最新研究进展,以期为卵巢癌的临床治疗研究提供方向。

鸡血藤抗肿瘤有效部位诱导A549肺癌细胞非凋亡性程序化死亡的研究

目的：探讨鸡血藤抗肿瘤有效部位（SSCE）对人非小细胞肺癌A549细胞的杀伤特点和作用机制。方法：采用四氮唑溴盐（MTr）法、绘制生长曲线观察药物对A549细胞增殖的影响。采用流式细胞术分析药物对肿瘤细胞周期的影响。通过HE染色和激光共聚焦扫描荧光显微镜技术、Annexin V-PI双标法，Caspase-3活性检测以及DNA琼脂糖凝胶电泳，观察药物对细胞凋亡的诱导作用。结果：SSCE对A549细胞有明显杀伤作用，24h药效最强，IC50为25．54mg·L^-1。细胞周期分析显示，药物作用12h，S期细胞增多，G0-G1和G2-M期细胞减少，细胞周期变化在24h后明显减弱，48h恢复正常。形态学观察可见，药物作用短时间内（8～12h），细胞核发生皱缩扭曲，胞浆内出现较多空泡及颗粒状物，胞膜完整；随后细胞核固缩。细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻在用药后12h最显著，具有时间-剂量依赖关系。Caspase-3活性无明显升高，且与剂量成反比。DNA琼脂糖凝胶电泳未见片断化梯形条带。结论：SSCE对A549细胞具有直接杀伤作用，药效迅速，细胞周期受到干扰（Sdelay），主要表现为非凋亡性程序化细胞死亡。

ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的形态学变化

目的研究前列腺素E受体亚型3(EP3)激动剂ONO-AE-248诱导的中性粒细胞(PMN)非凋亡性程序化细胞死亡的形态学变化,探讨PMN死亡形式的多样性和复杂性。方法运用透射电镜、荧光显微镜及激光共聚焦扫描显微镜观察PMN在自发性凋亡与ONO-AE-248刺激下亚细胞微结构的变化。结果以5mmol/L的ONO-AE-248刺激PMN12h后,电镜观察绝大多数PMN的多叶核融合为单叶核,核质疏松,核膜分层、起泡甚至破裂,核质溢出,但细胞膜较完整,细胞器无明显改变。以荧光染料DAPI标染活细胞核,ONO-AE-248刺激后,PMN表现为多叶核融合成大而模糊的球形,核染色密度较低;ONO-AE-248刺激的PMN死亡仍有细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)的外翻。ONO-AE-248刺激组与自发性凋亡组PMN在线粒体的形态结构、分布和细胞质内的染色性均有明显差异。结论ONO-AE-248在体外能刺激人PMN发生非凋亡性程序化细胞死亡,这一刺激过程不影响自发性凋亡的PMN细胞膜PS的外翻,并且细胞核和线粒体的改变是其早期最为显著的形态学改变,提示二者可能是ONO-AE-248刺激的靶标和早期的药物反应中心。

ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化死亡线粒体形态结构的变化

目的:探讨线粒体形态结构的变化在ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中的作用及意义。方法:Ficoll法分离健康志愿者外周静脉血中性粒细胞,与ONO-AE-248共同培养,透射电子显微镜观察线粒体形态结构的改变;流式细胞术检测线粒体膜势能的变化。结果:ONO-AE-248刺激6小时,中性粒细胞线粒体显著肿胀,嵴断裂,数目增多;ONO-AE-248早期迅速导致中性粒细胞线粒体膜势能的溃散。结论:线粒体变化是ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化死亡区别于凋亡的早期形态学特征事件之一。线粒体可能在ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡中扮演更为关键性的角色。

非凋亡性程序化细胞死亡的研究概况

细胞有2种基本死亡形式,即被动细胞死亡--细胞坏死和主动细胞死亡--程序化细胞死亡。凋亡是主动性细胞死亡,它是程序化细胞死亡的重要组成部分,但并非其唯一形式。最近研究表明还存在着其它的主动性细胞克亡,该细胞死亡过程中有RNA及蛋白质合成,为caspase非依赖性,形态学表现无细胞凋亡特征。由于有新的基因表达和新的蛋白质合成,因而称之为非凋亡性程序化细胞死亡。目前尚不知其确切的生物学意义,但近期研究表明它与发育和许多生理/病理现象有关。

ONO-AE-248诱发线粒体膜势能降低导致中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡

目的研究线粒体在ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡中形态结构及功能的变化情况,为进一步确立这一新的死亡形式和找寻其独特的死亡信号转导途径提供实验依据。方法体外新鲜分离人外周血中性粒细胞与ONO-AE-248共同培养,流式细胞术检测其线粒体膜势能的变化;激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体形态结构和分布情况。结果ONO-AE-248迅速导致中性粒细胞线粒体膜势能的溃散;ONO-AE-248刺激后中性粒细胞在线粒体形态、结构、分布和胞浆内染色特性等方面均与阴性对照有明显差异。结论线粒体变化是ONO-AE-248诱导中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡早期形态学上区别于凋亡的显著变化之一。线粒体膜通透性转变以及线粒体膜势能下降可能是ONO-AE-248诱导的非凋亡性程序化细胞死亡的主要原因。

大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后脊髓感觉神经元发生非凋亡性细胞程序性死亡

目的:观察大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后脊髓背角感觉神经元是否发生非凋亡性细胞程序性死亡(paraptosis)。方法:成年雄性SD大鼠20只,随机分为正常组,手术组。手术组建立慢性压迫性损伤(CCI)模型,又分为术后3d、7d、14d组。实验动物以4%多聚甲醛PBS液灌注内固定,取与坐骨神经相应的腰4～腰6节段脊髓,于2.5%戊二醛中固定,透射电镜观察左侧脊髓背角浅层神经元超微结构并摄片。结果:电镜下,术后3d组腰4～腰6节段脊髓左侧背角浅层神经元形态学典型变化为:细胞肿胀,胞膜完整,胞浆内大量空泡,核结构基本正常,符合paraptosis形式程序性细胞死亡表现;7d和14d组神经元形态变化:细胞皱缩、密度增大,核带增多及染色质浓聚贴附于核膜,符合凋亡表现。结论:坐骨神经损伤3d腰4～腰6节段脊髓背角浅层神经元发生了parapto-sis形式程序性细胞死亡。

ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中Mcl-1表达的研究

目的研究淋巴瘤细胞株的髓细胞白血病1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)在ONO-AE-248刺激的中性粒细胞(polymorpho nuclear neutrophils,PMN)非凋亡程序化细胞死亡中的作用,为进一步确定这种新型细胞死亡模式提供线索。方法 Ficoll法新鲜分离健康志愿者外周静脉血中性粒细胞,与ONO-AE-248共同培养运用流式、RT-PCR和Western-bloting技术,对接受ONO-AE-248刺激的PMN的Mcl-1的表达进行检测。结果 ONO-AE-248刺激2 h时中性粒细胞Mcl-1 mRNA的表达明显上调,特异性抗Mcl-1单克隆抗体通过Western blotting技术检测发现其在凋亡组与非凋亡组的表达有明显差异性,表现为上升的趋势。结论 Mcl-1在ONO-AE-248诱导的非凋亡性程序化死亡中蛋白表达的上调可能是中性粒细胞凋亡和ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的关键性差异点。Mcl-1在ONO-AE-248诱导的非凋亡性程序化死亡和传统凋亡中发挥的调控作用可能是不相同的。

ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡的蛋白质组学分析方法的建立

目的:建立双向电泳技术和质谱技术在探索ONO-AE-248诱发的中性粒细胞(neutrophil,PMN)非凋亡性程序化死亡的分子机理研究中的应用,为深入认识“非凋亡性程序化死亡”这种新的死亡方式提供新的有效的研究途径。方法:将采用梯度离心法分离的,人正常PMN,分为正常对照组和实验组,实验组用ONO-AE-248刺激12小时建立非凋亡性坏死模型,提取对照组和实验组全蛋白,双向电泳分离蛋白质,采用PDQuest2-DE软件分析找出两组间差异表达的蛋白质斑点,用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果:双向电泳图谱显示:ONO-AE-248诱导的人PMN非凋亡性程序化细胞死亡与PMN的自发性凋亡的蛋白质组存在差异显著,质谱鉴定初步得到其中12种差异表达的蛋白质。结论:双向电泳和质谱鉴定技术可以有效的分离和分析ONO-AE-248诱发的PMN非凋亡性坏死的蛋白质组,为进一步探索“非凋亡性程序化死亡”方式提供了新的方法和途径,为丰富细胞死亡方式带来了新的前景。

ASC在ONO-AE-248诱发的中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中的作用

目的:探讨接受ONO-AE-248刺激后重要的差异表达蛋白——凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)的表达及意义。方法:Ficoll法新鲜分离健康志愿者外周静脉血中性粒细胞(Polymorpho-nuclear neu-trophils,PMN),与ONO-AE-248共同培养,2小时提取总RNA,并行反转录-PCR检测ASC mRNA的表达;12小时提取总蛋白,双向电泳分离后,采用PDQest2-DE软件分析找出差异表达的蛋白质斑点,并用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果:ONO-AE-248刺激2小时中性粒细胞ASC mRNA的表达明显下调(P<0.01);12小时通过双向电泳和蛋白质质谱分析发现ASC为重要的差异表达蛋白且ONO-AE-248刺激后的表达量明显低于自发性凋亡组。结论:ONO-AE-248引起的ASC表达的下调可能是中性粒细胞凋亡和ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的关键性差异点。ONO-AE-248显著下调ASC的表达,可能是ONO-AE-248诱使中性粒细胞发生非凋亡性程序化死亡的根本原因之一。

ONO-AE-248对诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中Bax-α表达的研究

目的:为探讨接受ONO-AE-248刺激后重要的表达蛋白—Bax-α在中性粒细胞(Polymorphonuelearneutrophils,PMN)非凋亡程序化细胞死亡中的表达及意义,以进一步确定这种新型细胞死亡模式提供线索。方法:采用Ficoll法新鲜分离健康志愿者外周静脉血PMN与ONO-AE-248共同培养12 h后,流式观察ONO-AE-248对细胞活性的影响并提取总RNA,并行反转录-PCR检测Bax-αmRNA的表达;Western-blot检测Bax-α蛋白的表达。结果:ONO-AE-248刺激12 h时PMN Bax-αmRNA的表达与空白组比较无明显变化(P>0.05);蛋白印迹法显示,Bax-α蛋白的表达无差异;流式结果显示,ONO-AE-248刺激的中性粒细胞发生快速死亡。结论:Bax-α在ONO-AE-248诱导的非凋亡性程序化死亡中可能发挥着部分相同或相关的作用。

ONO-AE-248诱发的中性粒细胞非凋亡、非坏死性死亡

目的:观察前列腺素E2受体亚型3(EP3)激动剂ONO-AE-248对中性粒细胞的影响。方法:运用电子显微镜、MTS法、RT-PCR和流式细胞术等技术,对中性粒细胞的形态变化、生物学活性及凋亡进行观察和评估,并对EP3受体进行分析。结果:中性粒细胞存在EP3受体基因的表达,以5mmol/L的ONO-AE-248作用12h后,其多叶核融合为单叶核,核膜起泡、破裂,核质溢出,细胞死亡;但其快速死亡不具有细胞凋亡和坏死的形态特征且需要能量(ATP)供应。结论:ONO-AE-248所致这种新型细胞主动死亡的形式,可能为“非凋亡性程序化细胞死亡”的一种,这对于重新认识和定位中性粒细胞在非特异性免疫中的作用和地位提出了新的思路。

ASC在ONO-AE-248诱导的中性粒细胞非凋亡、非坏死性死亡中的表达

目的:探讨凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein,ASC)在ONO-AE-248所诱发的中性粒细胞非凋亡、非坏死性死亡中的作用及意义。方法:TUNEL法标记凋亡细胞,结合激光共聚焦扫描显微镜观察细胞核形态以及DNA片段化发生的情况;Western blot法检测不同药物刺激组(LPS延迟凋亡组、TNF-α促进凋亡组、ONO-AE-248刺激组以及自发性凋亡组)的ASC蛋白的表达差异性。结果:TUNEL法检测ONO-AE-248培养12小时后的中性粒细胞,未见TUNEL阳性细胞。Western blot结果显示ONO-AE-248刺激后中性粒细胞ASC蛋白的表达一直处于下调状态。结论:ONO-AE-248诱导人中性粒细胞死亡过程中细胞核DNA断裂方式明显不同于自发性凋亡组,核内染色体可能只发生DNA较大片段的断裂,而没有发生小片段化。ONO-AE-248引起的ASC表达的下调可能是这种新型细胞死亡方式区别于自发性凋亡的重要差异点。

Paraptosis——一种新的细胞死亡方式

人们一直认为细胞死亡有两种方式—细胞坏死和凋亡。但最新研究表明还存在一种非凋亡性细胞程序性死亡 ,命名为paraptosis。Paraptosis在形态学上与凋亡不同 ,不具有凋亡的典型特征 ,即缺少染色质的新月形凝集和凋亡小体。它是以胞浆空泡的形成为特征 ,在整个过程中胞浆和胞核密度增加 ,线粒体肿胀 ,但细胞膜和细胞器仍保持完整 ;无“阶梯状DNA区带” ,ISEL ,TUNEL标记为阴性。paraptosis过程中有RNA及蛋白质合成 ,并为caspase非依赖性的。目前已知 paraptosis与许多生理和病理现象相关。

中性粒细胞非凋亡性程序化细胞死亡的研究概况

中性粒细胞是机体固有免疫应答的主要效应细胞，也是机体内重要的炎症细胞。中性粒细胞除了凋亡和坏死外，还存在一种非凋亡性程序化细胞死亡形式。该形式具有空泡化，线粒体通透性增大等形态学特征，具有caspase-3、caspase-8非依赖性以及无DNA片段化的生物化学特征。目前尚不知其确切的生物学意义，但它与发育和许多生理／病理现象有关。这些研究成果对于重新认识和定位中性粒细胞程丰化细胞死亡的多样性和复杂性提出了新的思路。

ONO-AE-248对诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中A1表达的研究

为探讨接受ONO-AE-248刺激后重要的表达蛋白-A1在中性粒细胞(polymorphonuelear neutrophils,PMN)非凋亡程序化细胞死亡中的的表达及意义,以进一步确定这种新型细胞死亡模式提供线索。采用Ficoll法新鲜分离健康志愿者外周静脉血PMN,与ONO-AE-248共同培养2 h后提取总RNA,并行反转录-PCR检测A1 mRNA的表达;Western blot检测A1蛋白的表达;透射电镜观察线粒体形态结果的变化。结果发现,ONO-AE-248刺激2 h时PMN A1 mRNA的表达明显上调(P<0.01);蛋白印迹法显示A1蛋白的表达增高;透射电镜观察ONO-AE-248刺激下的早期PMN线粒体超微形态结构发生了剧烈改变。提示ONO-AE-248引起A1表达的上调可能是ONO-AE-248诱使中性粒细胞发生非凋亡性程序化死亡的根本原因之一。

蓝舌病毒湖北株致人肝癌Hep-3B细胞和人肺腺癌A549细胞死亡机制的研究

目的探讨蓝舌病毒湖北株(BTV-HbC3)致人肝癌Hep-3B和人肺腺癌A549细胞死亡的方式及其作用机制。方法观察细胞感染BTV-HbC3的病变效应;原位末端标记(TUNEL)法检测细胞感染BTV-HbC3是否出现凋亡;激光打描共聚焦显微镜检测荧光标记的细胞核及内质网变化;萤光照度仪检测病毒诱导细胞caspase-3/7、caspase-8和caspase-9的活性变化。结果BTV-HbC3感染Hep-3B细胞后有明显的病变效应,大量细胞凋亡,细胞核染色质边聚,内质网大量空泡形成,caspase- 3/7活性升高,caspase-8和caspase-9未升高;BTV-HbC3感染A549细胞后有明显病变效应,仅见零星凋亡细胞,内质网有空泡形成,细胞核未见染色质边聚,caspase-3/7和caspase-9活性升高,caspase-8未升高。结论BTV-HbC3主要通过细胞内内质网途径诱导Hep-3B细胞凋亡而发挥其抑瘤作用,而对人肺腺癌的抑瘤作用则是通过诱导A549细胞的非凋亡性程序性死亡来实现的。