质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系蛋白质变化

利用基于液相色谱串联Orbitrap质谱(Q Exactive)的非标定量(Label-free)技术,对小麦抗病单基因近等基因系Taichung29*6/Yr10和背景品种Taichung29叶片的蛋白质表达进行了比较分析。经MASCOT软件搜库,在两个样品中共同鉴定到2 257个蛋白,其中有准确定量信息的蛋白共1 549个,含量变化大于2倍的差异蛋白有102个。对102个差异表达蛋白进行了Gene Ontology(GO)功能注释和分析,发现他们多数定位于细胞基质和核糖体等细胞器,具备结合、催化等功能,主要参与代谢、细胞过程、应激等生物学进程,其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶体-β-葡萄糖苷酶和铁蛋白等可能与小麦抗病单基因近等基因系Taichung 29*6/Yr10的抗病性有一定相关性。

基于液相色谱质谱联用的蛋白质组非标记定量研究策略的建立及应用

定量蛋白质组研究是蛋白质组研究的热点和难点,而液相色谱质谱技术已经被广泛地应用于蛋白质的定性和定量研究.该研究建立和优化了一种基于液相色谱质谱联用技术的蛋白质组非标记定量方法,并对两种肽段质谱检测计数的归一化算法进行了比较,结果发现ASC法要优于RSC法.最后,将建立的方法应用于肝癌细胞模型HepG2和HepG2-HBx细胞系的差异蛋白质组表达研究.质谱鉴定结果用聚类分析软件Cluster3.0进行分析,最后鉴定出107个重叠蛋白,其中9个蛋白质表达上调(Ratio>1.75),6个蛋白质表达下调(Ratio<0.5),这些蛋白质均与肝癌发生和恶化密切相关.结果表明,该技术操作简单、方便,具有较高的灵敏度和动态范围,利用该方法进行差异蛋白质组研究和发现生物标志物在理论和临床上具有十分重要的意义.

不同养殖模式大黄鱼非标记定量差异蛋白组学分析

通过非标记定量蛋白质组学技术研究不同养殖模式大黄鱼的蛋白质差异。选取普通网箱养殖大黄鱼和深水网箱养殖大黄鱼,提取肌肉总蛋白,通过高效液相色谱-质谱联用技术进行鉴定、分析。质谱数据使用MaxQuant软件将峰信号转化为肽段/蛋白的表达矩阵数据,然后使用Perseus软件可视化展示数据。不同养殖模式大黄鱼蛋白质进行Student’s t检验,筛选出差异表达蛋白后并对其进行基因功能分类、代谢通路富集和蛋白质相互作用网络分析,以P<0.05为差异有统计学意义。通过数据库比对获得6077条多肽,分别对应于1232个蛋白,其中130个蛋白在大黄鱼间存在显著差异表达,76个上调蛋白,54个下调蛋白,其中上调倍数最高的属于TCP伴侣蛋白,下调倍数最高的属于α-1(I)链状胶原蛋白。生物信息学分析发现,不同养殖模式大黄鱼蛋白质的差异主要在于热休克蛋白、伴侣蛋白、球蛋白及胶原蛋白等,而不同养殖模式中环境温度可能是导致大黄鱼蛋白质显著差异表达的主要因素。

基于非标记定量蛋白质组学技术研究RyhB调控禽致病性大肠杆菌酸性耐受力

为从蛋白水平上探究ryhb对大肠杆菌酸性耐受力相关基因的影响,本研究采用非标记定量(Label-free)蛋白质组学技术对禽致病性大肠杆菌(APEC)野生株和△ryhb基因突变株进行蛋白质组学的差异性比较,并利用荧光定量PCR技术进行验证。本实验共检测到121个差异表达蛋白,其中44个蛋白的表达水平上调,19个蛋白的表达水平下调。为研究ryhb对表达蛋白的影响情况,并鉴定受其调控的相关基因,从上述差异蛋白中筛选出了hdea、hdeb、gada、gadb等与酸性耐受力相关的蛋白,并在基因水平进行验证。本研究表明,ryhb基因的缺失可能与上述4个耐酸基因转录水平上调相关,进而增强APEC耐酸性。本实验为初步探究ryhb调控通路,对APEC致病性影响提供了一定的实验依据。

P-QuantWiz:一种基于质谱的并行非标记定量软件

本文设计并实现了基于质谱的非标记定量软件QuantWiz,通过改变肽段定量的顺序,提高了定量软件的时间局部性和质谱数据缓存的命中次数。分析了QuantWiz的多种数据并行策略,设计并实现了按保留时间划分的并行定量软件P-QuantWiz。通过实验验证P-QuantWiz具有良好的并行效率,当进程数为32时,并行效率为63%。

非小细胞肺癌与良性肺结节非标记定量血浆蛋白质组学分析

目的:基于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)与良性肺结节(benign pulmonary nodules,BPN)患者血浆蛋白质组学分析,寻找良恶性肺结节鉴别诊断相关蛋白标志物。方法:采用非标记定量蛋白质组学技术,以10例BPN患者为对照,对10例肺鳞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)、10例肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)患者进行血浆蛋白质组学分析。对不同比较组间的可定量蛋白进行基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)。以差异倍数>1.2(上调)或<1/1.2(下调)且P<0.05为标准筛选差异蛋白。应用String网站和R语言对差异蛋白进行基因本体论(gene ontology,GO)分析和主成分分析(principal component analysis,PCA)。结果:LUSC组与BPN组间比较发现380个可定量蛋白,其中20个差异蛋白。GSEA结果显示,可定量蛋白主要富集在肿瘤坏死因子信号通路、代谢途径、碳代谢等通路(P<0.05)。PCA结果显示,差异蛋白可明显区分LUSC与BPN患者。GO分析结果表明,20种差异蛋白大多以细胞外泌体的形式存在或主要位于细胞外间隙和胞外区,且主要富集于组织重塑的调节、细胞黏附等的生物学过程以及肝素结合、肽链内切酶抑制剂活性等的分子功能。LUAD组与BPN组间比较共得到350个可定量蛋白,包含12个差异蛋白。GSEA分析发现,其显著富集的通路有细胞因子与细胞因子受体的相互作用、趋化因子信号通路、代谢途径等(P<0.05)。PCA结果同样显示,差异蛋白可明显区分LUAD和BPN患者。GO分析结果表明,该12种差异蛋白主要富集于有机循环复合物应答的生物学过程和芳香酯酶活性的分子功能;细胞定位分析发现,其大多也以细胞外泌体的形式存在或主要位于细胞外间隙和胞外区。结论:良恶性肺结节患者血浆蛋白存在明显差异,可为发现良恶性肺结节鉴别诊断的新型标志物提供线索。

非标记定量技术检测特应性皮炎患儿尿液中差异蛋白的应用

目的应用非标记定量技术研究特应性皮炎患儿尿液中的差异表达蛋白,筛选特应性皮炎患儿尿液中的特异性蛋白质标记物。方法收集特应性皮炎患儿和健康对照者的尿液各6份,处理和提取尿液蛋白质,经一维SDS-PAGE和蛋白胶内酶解获得肽段,应用高效液相色谱串联质谱鉴定,使用Mascot软件查询并用Scaffold软件作相对定量分析。结果特应性皮炎患儿组和健康对照组的尿液共检测出103种表达差异倍数大于1.5倍的蛋白质,患儿组表达升高的有48种蛋白质,表达降低的有55种蛋白质,其中10种蛋白质仅在患儿组检测到,17种蛋白质仅在对照组检测到。结论特应性皮炎患儿与正常儿童尿液间存在蛋白质表达差异。

基于GPU的非标记定量软件QuantWiz并行化实现

QuantWiz是一款基于质谱的非标记定量软件,可很好地应用于定量蛋白质组学。实验数据的日益增大,使定量的计算量巨大,耗费时间长。GPU以几百GFlops甚至上TFlops的运算能力,为定量蛋白质组学这样的计算密集型应用提供了良好的加速方案。对QuantWiz软件做了深入的研究与分析,找到了软件性能的热点模块所在,提出了该软件在GPU上的加速方案———GPU-QuantWiz,并进行了实现。性能测试显示,在Tesla C1060上,该方案的平均加速比达到9.66倍,得到了良好的加速效果。同时,该方案还可以扩展到两块及以上的GPU上,具有良好的可扩展性。

带状疱疹后遗神经痛患者血清非标记定量蛋白质组学分析

目的采用非标记定量蛋白质组学技术检测带状疱疹后遗神经痛(PHN)患者血清差异表达的蛋白质,探讨PHN可能的发病机制。方法选择带状疱疹患者80例,经治疗后存在神经痛症状者40例(观察组)、不存在神经痛症状者40例(对照组)。收集两组治疗前的血液,采用非标定量法蛋白质组学技术分析血清中的差异蛋白。结果与对照组比较,观察组有4种蛋白质表达下调、7种蛋白质表达上调。进一步的差异蛋白分析结果显示,表达下调的4种蛋白质分别为纤维胶凝蛋白1(FCN1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族D成员1(SERPIND1)、脱脂转化酶(LPA)和蛋白二硫化物异构酶A4(PDIA4),表达上调的7种蛋白质分别为Wnt诱导信号通道蛋白2(WISP2)、免疫球蛋白λ变量1-44(IGLV1-44)、免疫球蛋白重常数γ1(IGHG1)、载脂蛋白C3(APOC3)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、中间α-球蛋白抑制因子H1(ITIH1)和C1Q肿瘤坏死因子相关蛋白3(C1QTNF3)。结论PHN患者血清FCN1、SERPIND1、LPA、PDIA4蛋白表达下调,WISP2、IGLV1-44、IGHG1、APOC3、LGALS1、ITIH1和C1QTNF3蛋白表达上调,上述差异表达蛋白可能参与了PHN的发病。

非标记定量蛋白质组学分析冻结方式对中华管鞭虾肌肉差异蛋白质的影响

为了探究冻结方式对中华管鞭虾(Solenocera melantho)肌肉差异蛋白质的影响,本试验运用非标记(label-free)定量蛋白质组学技术,研究液体浸渍冻结、真空包装结合浸渍冻结、静止空气冻结、真空包装结合空气冻结4种方式对中华管鞭虾差异蛋白表达的影响。结果表明,与新鲜中华管鞭虾相比,上述4种冻结方式处理后的虾肌肉中分别有269、162、299、289个差异蛋白,其中表达上调的蛋白分别有100、59、63、61个,表达下调的蛋白分别有169、103、236、228个。筛选出甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD^+)、β-胸腺素2个差异蛋白,有望成为与冻结中华管鞭虾品质变化相关的指示蛋白标志物。本研究为深入了解中华管鞭虾在不同冻结方式下的品质变化机制,以及寻找出与新鲜度相关的指示蛋白提供了理论依据,也为虾的冻结工艺技术提供了参考。

非标记定量方法分析雌雄同株黄连木花芽分化关键期的差异蛋白

为确定雌雄同株黄连木两个花芽分化关键期中差异化表达的蛋白质,为探明其性别决定机制提供蛋白质层面的线索,本研究利用非标记定量蛋白质组学技术,对雌雄同株黄连木上雌花和两性花在两个花芽分化关键物候期中的差异蛋白表达及其相关通路进行了定量分析。结果表明:在5月下旬雄性器官分化的过程中与抗氧化应激、核糖体活动以及光合作用相关的蛋白出现了上调;而在第2年3月上旬雌性器官分化的过程中与抗氧化应激相关的蛋白出现了上调,与光合作用相关的蛋白出现了下调。与第2年3月上旬相比,第1年5月下旬雌花和两性花中与光合作用相关的蛋白均显著上调,与核糖体活动相关的蛋白均显著下调。

3种不同的HPV型别宫颈癌细胞株分泌蛋白非标记定量技术分析

目的:分析3种不同HPV型别的宫颈癌细胞株Siha、Caski和C33的分泌蛋白表达及种类,寻找其共性分泌蛋白标志物,为临床早期发现及针对性干预提供依据。方法:采用非标记(label-free)定量技术分析3种不同宫颈癌SiHa、Caski和C33细胞株的分泌蛋白,运用LC-MS/MS和Maxquant的非标记技术,筛选出宫颈癌分泌蛋白的种类及分类。结果:共鉴定肽段数21 609个,蛋白数2 895个。其中3种宫颈癌细胞株共性蛋白共729种,占29.2%;特异性蛋白Siha细胞株含128种,Caski细胞株含143种,C33细胞株含859种。对于结果中729种共性蛋白进行分析,有以下4类较为集中的类型:热休克蛋白类(HSPs)共14种;异质性核糖核蛋白类(HNRP)共8种;层黏连蛋白类(LN)共4种;阿尔多酮还原酶1类(AKR1)共2种。其中,溶酶体信号通路所占比例最大(39种)。结论:SiHa、Caski和C33细胞株的分泌蛋白中共有729种共性蛋白,其中4类集中的蛋白类型均先后在研究中证实对宫颈癌的进程和发展有影响,并且可能与溶酶体信号通路有关。可为筛选高危型HPV感染的宫颈癌患者的血清标志物提供依据。

应用非标记定量蛋白组学研究帕金森病差异表达蛋白

目的寻找帕金森病(PD)患者血清中差异表达的蛋白,探索PD生物学标志物。方法选择在北京医院临床确诊的PD患者24例,其中12例为仅有PD病史(P1组),另12例合并有高血压病、糖尿病基础疾病(P2组);筛选24例年龄、性别匹配的体检者(对照组C1和C2组),采集血清标本去除高丰度蛋白后,应用非标记定量蛋白组学技术检测各组血清中蛋白表达,采取双重对比将P1组与C1组、P2组与C2组比较,分别筛查出差异表达蛋白,再从中筛选出表达变化(上调或下调)一致的蛋白,确定为PD差异表达蛋白,并用生物信息学方法分析解释。结果各组对比后,共鉴定出4种差异表达的蛋白为PRG4、CFHR-3、ACTG1、HIST2H2BF,其中PD患者的血清中PRG4、CFHR-3表达上调,ACTG1、HIST2H2BF表达下调且存在一定的相互作用。结论应用非标记定量蛋白组学筛选出了帕金森差异表达的蛋白,可能对帕金森病的诊断具有一定的意义。

里氏木霉磷酸化蛋白质组的非标记定量分析

目的:利用液相色谱串联质谱和非标定量技术,研究里氏木霉中磷酸化蛋白在不同培养条件下的表达差异,以期获得与纤维素酶表达调控相关的磷酸化蛋白。方法:分别在阻遏条件、诱导条件和中性条件下培养里氏木霉,提取胞内总蛋白,进行酶切和非标记定量分析。结果:对比诱导条件与阻遏条件、诱导条件与中性条件、阻遏条件与中性条件下培养的里氏木霉的胞内蛋白表达量差异,分别发现差异蛋白90、61和90个。根据其功能,可将这些差异蛋白归为四类,即锌指蛋白、ATP结合蛋白、具有N-乙酰化转移酶活性的蛋白以及具有氧化还原酶活性的蛋白。它们主要参与糖酵解、蛋白质合成、DNA修复以及转录调节过程。结论:发现的这些差异蛋白为研究调控纤维素酶的表达调控提供了新的线索。

非标记定量蛋白质组学研究干燥方式对牡丹花差异蛋白质的影响

在蛋白质水平上,研究干燥方法(真空冷冻干燥、热风干燥、自然干燥)对牡丹花瓣的影响及作用机理。采用非标记定量蛋白质组学技术对牡丹花瓣进行蛋白质组学的差异性比较,并对差异蛋白质进行GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注释富集分析,探讨加工方式对代谢通路的作用机制。结果表明:三组样品共定性1423个蛋白质,定量1349个,占总数94.80%;真空冷冻干燥样品FD、热风干燥样品HD、自然风干样品ZD定量蛋白质分别为1325、677、1085个,三组样品共同的定量蛋白质有656个。与HD比较,ZD显著差异蛋白质77个,上调24个,下调53个;77个显著差异蛋白质GO、KEGG分析表明,蛋白质主要集中在糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、TCA循环、内质网蛋白质加工通路。结论:加工方式对牡丹花蛋白质差异影响显著,该研究首次对采用蛋白质组学方法分析牡丹花差异蛋白的表达变化,为不同加工方法在实践中提供科学依据。

冬枣果实发育过程中非标记定量蛋白质组学分析

考察冬枣不同成熟阶段的蛋白质组,分析差异表达蛋白质及功能,为研究冬枣成熟发育机制提供理论依据。采集开花后第55(幼果期)、76(果实膨大期)、96(果实白熟期)、116天(果实脆熟期)的沾化冬枣样品,利用非标记定量蛋白质组学技术对4个阶段冬枣样品蛋白质组进行分析,各阶段样品与前一阶段相比,得到差异表达蛋白质,并进行基因本体论(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。结果表明,4个阶段样品共定性2107个蛋白质,定量1986个蛋白质,各阶段果实与前一阶段相比差异表达蛋白质分别为96、185、138个;差异蛋白质GO显示,主要富集单一生物细胞过程、单一生物代谢过程、化学响应、压力响应等生物学过程。KEGG代谢通路表明,差异表达蛋白显著富集在光合作用、类黄酮生物合成、柠檬烯和蒎烯降解、苯丙烷类生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢以及核糖体合成等。冬枣果实不同发育阶段蛋白质组差异显著,差异蛋白质主要参与能量代谢、遗传信息处理和其他次生代谢物的生物合成等途径。

一种结合生物医学知识的蛋白质组非标记定量分析方法及其应用

基于质谱的非标记定量方法能够对复杂蛋白质组进行规模化分析,同时,在定量分析的基础上理解和解释蛋白质组的功能和相互作用关系更有意义.这需要建立一种有效的兼容定量和定性分析结果的方法.针对这一需求,本文首先借鉴了NSAF(normalized spectral abundance factor)算法采用肽段计数对蛋白质组数据进行定量,进一步结合共享肽对该方法进行优化.以此为基础,通过g:Profiler获取海量蛋白质组的功能注释信息,在定量分析的过程中,同步实现了对蛋白质组数据的功能性分析.本文选择来自人心脏、小鼠心脏、小鼠肝脏的三组线粒体蛋白质组数据对该方法进行验证,按照功能性分析将三组数据划分为若干功能组或信号通路,并进行相关性、功能聚类以及电子传递链分析.结果表明,结合共享肽的优化算法克服了对低丰度蛋白质的错误估计,提高了非标记定量的准确性.同时,结合生物医学知识的分析方法解释了蛋白质组的功能和相互作用关系,为差异比较蛋白质组学、疾病蛋白质组学以及功能蛋白质组学等组学研究提供了新的方法.

基于非标记定量法的三疣梭子蟹精子塞蛋白质组学研究

三疣梭子蟹是我国重要经济蟹类。运用基于质谱的非标记蛋白定量技术,对三疣梭子蟹交配后所形成精子塞上下两部分的蛋白成分进行了比较分析。结果表明:三疣梭子蟹精子塞的上下两部分蛋白成分存在明显差异,共有22个差异表达蛋白家族。经生物信息学分析,差异表达蛋白主要来自于细胞、细胞组分、细胞器以及大分子复合物,以结合和催化活性功能为主,主要参与代谢、细胞以及单生物等生物学过程。其中,蛋白表达水平下调27个。差异蛋白富集的主要信号通路有催产素信号通路,内质网蛋白加工通路等。三疣梭子蟹精子塞形成的关键蛋白可能包括肌动蛋白与结合蛋白。同时结果表明精子塞的形成可能还与细胞内质网腔的氧化还原酶有关。

^(60)Co γ射线全身 照射大鼠尿液的非标记定量蛋白质组学分析

目的:鉴定全身照射大鼠尿液中的异常表达蛋白质,筛选辐射敏感生物标志,并分析其功能和相关生物学过程。方法:以未照射大鼠为阴性对照,分别采用1、5 Gy(剂量率1 Gy/min)的60Coγ射线全身照射30只大鼠,收集照射后第1和第3天的尿液样本,采用非标记(label-free)质谱技术检测样本中所鉴定蛋白的相对表达水平,筛选差异表达蛋白,进一步使用Uniport、DAVID数据库对其进行基因本体(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并使用STRING在线网站构建蛋白-蛋白相互作用网络。结果:本研究各样本共鉴定出1069种蛋白。照射后第1和第3天,与对照组比较1和5 Gy照射组均出现差异表达的蛋白279种,其中190种表达上调,97种表达下调。GO富集分析结果显示差异蛋白主要涉及对药物反应、氧化还原、老化等生物学过程,分布在细胞外泌体、细胞外空间等区域,发挥蛋白质同源二聚化活性、蛋白质结合以及钙离子结合等分子功能。KEGG富集分析结果显示差异蛋白主要涉及抗生素生物合成、谷胱甘肽代谢、碳代谢、代谢途径等多种信号通路。结论:γ射线照射后大鼠尿液蛋白质组学的综合分析表明,Gusb、Reg3g、GCLM、AZGP1蛋白上调和Ly6d蛋白下调可作为辐射敏感候选生物标志。

基于非标记定量技术的3种毛皮海狮蛋白组学分析研究

试验旨在通过非标记定量技术对非澳毛皮海狮、南美毛皮海狮、智利毛皮海狮的胡须进行蛋白组学分析,探讨3种海狮间的亲缘关系。首先采集海狮胡须样品,提取总蛋白,再对蛋白进行浓度测定、电泳、酶解和肽段除盐等处理。得到的样品进行色谱与质谱分析、数据库检索、相关性分析与层次聚类分析、差异蛋白筛选与GO富集分析。结果表明:南美毛皮海狮N1与智利毛皮海狮Z1蛋白差异不明显、相关性强,自身表达量分布均匀;非澳毛皮海狮F1与这两种毛皮海狮间蛋白差异较为显著、相关性弱,自身表达量相对分布不均匀。说明非澳毛皮海狮和其他两种海狮亲缘关系较远,有相对明显的遗传差异,属于海狮科海狗属;而南美毛皮海狮与智利毛皮海狮的亲缘关系较近,可能为不同亚种。