基于响应面法的非洲哈茨木霉AD-G4菌株固体发酵条件优化

【目的】为了获得非洲哈茨木霉AD-G4固体发酵的最佳条件。【方法】利用单因素试验、BBD(Box-Behnken Design)响应面试验对非洲哈茨木霉AD-G4菌株的固体发酵培养基、发酵条件等影响因素进行了优化。【结果】适合此菌株产生的最佳培养基组成为:燕麦粉和小麦秸秆1∶1;最佳培养条件为初始p H值7.0,含水量52%,孢子浓度5.40×10^(6)个/m L,温度28℃,培养天数为8 d。【结论】在优化的培养条件下,非洲哈茨木霉AD-G4分生孢子产量达到1.91×10^(10)个/g。通过培养条件优化确定了适合非洲哈茨木霉AD-G4菌株产生分生孢子的条件,为高效开发非洲哈茨木霉生防菌剂奠定了基础。

非洲哈茨木霉产抑菌挥发性有机物碳源代谢机制

【目的】获得生防菌非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)ACCC 33109高产抑菌挥发性有机物的突变菌株,并分析其碳源代谢以挖掘高产抑菌挥发性有机物的机制。【方法】通过原生质体紫外诱变野生株ACCC33109获得突变株,以对扣法筛选挥发性有机物抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)活性差异大的突变菌株,利用Omnilog表型芯片技术比较野生株ACCC 33109和突变株MU153、MU792对不同种类碳源代谢的差异特征。【结果】野生株ACCC 33109经紫外线诱变2.0 min(致死率为76.63%)共获得828个突变株,对扣法筛选获得30个挥发性有机物对尖镰孢抑制率高于野生株的突变株,其中突变株MU153抑菌率高达53.86%,较野生株提高了16.68%,而突变株MU792的抑菌率降至15.83%。盆栽试验表明非洲哈茨木霉ACCC 33109和MU153菌株均对黄瓜具有促生作用,对黄瓜枯萎病有防治作用,与野生株ACCC 33109相比,突变株MU153对黄瓜枯萎病的相对防治效果提高了15.88%,相对于清水对照,防病效果高达89.69%。另外,紫外诱变导致突变株的菌落、菌丝、分生孢子梗和孢子形态发生了变化,相对于ACCC 33109,MU153菌丝变为絮状、生长速度快、密度大、并有色素产生,而MU792菌丝生长速度慢、密度低、菌落后期由绿色变为白色;突变株MU153和MU792分生孢子梗增大、孢子变大,且分生孢子梗基部宽度降低。紫外诱变引起突变株对碳源代谢能力的改变,相对于ACCC 33109,MU153对FF板中46种物质的代谢能力较高,包括D-阿拉伯醇、二胺乙醇、麦芽糖、熊果苷、纤维二糖和α-D-葡萄糖等,对其他50种物质的代谢能力低于ACCC 33109,包括对羟基苯乙酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、糖原、溴代丁二酸和L-苏氨酸等。MU792对FF板中27种物质的代谢能力较高,包括γ-羟丁酸、葡萄糖-1磷酸、β-羟丁酸、D-乳酸甲酯、D-山梨醇和丙酰胺等,对其他69种物质的代谢能力低于ACCC 33109,包括琥珀酰胺酸、N-乙酰-D-葡萄糖胺、对羟基苯乙酸、葵二酸、吐温-80和D-糖质酸。α-D-葡萄糖最利于抑菌挥发性有机物的产生,以α-D-葡萄糖为碳源时,ACCC 33109、MU153和MU792的挥发性有机物对尖镰孢的抑菌率依次为48.08%、56.17%和40.94%。【结论】非洲哈茨木霉突变株MU153具有高产抑菌挥发性有机物的能力,以α-D-葡萄糖为碳源时抑菌效果更佳,是一株具有应用潜力的生防菌。

哈茨木霉复合种内3个中国新记录种的分离和鉴定

采用THSM选择性培养基,从西藏、山东和云南等地的土壤中分离获得木霉菌株Z19、CX58-4和CY358-5。通过形态学特征、ITS r DNA和TEF-1α序列对菌株进行鉴定。结果表明,3个菌株属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)复合种,分别是非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)、深褐木霉(T.atrobrunneum)和西蒙斯木霉(T.simmonsii),均为木霉属中国新记录种。

木霉微生物菌肥的制备及对玉米茎腐病的应用评价

以前期分离鉴定的生防菌株非洲哈茨木霉Tr35为研究对象,通过载体的筛选,制备木霉菌剂和木霉微生物菌肥。通过测定不同含量的木霉菌剂和木霉有机肥的株高、根长和鲜重,筛选促生效果明显的处理,并通过室内盆栽试验,评价其对玉米苗期茎腐病的防效。结果显示,玉米秸秆粉具有吸水性强、对Tr35无毒和高释放率的优点,与Tr35共同发酵制备木霉菌剂,当土与菌剂为5∶1时,促生效果明显,并对玉米苗期茎腐病防效达51.77%。菌剂土与腐熟羊粪为7∶1时的木霉有机肥促生效果最好,以该比例制备木霉微生物菌肥,对玉米苗期茎腐病防效达61.31%,该研究结果为Tr35菌剂和菌肥的应用开发提供了一定的前期基础。

玉米腐霉茎腐病生防木霉菌株的筛选、鉴定及防治效果分析

【目的】筛选对玉米腐霉茎腐病病原菌具有抑制作用的木霉(Trichodermaspp.)菌株,明确其分类地位以及对腐霉茎腐病的防治效果和抑菌机理,为腐霉茎腐病生防制剂的研发提供菌种资源。【方法】采用菌丝生长速率法测试候选木霉菌株对肿囊腐霉(Pythiuminflatum)、强雄腐霉(P.arrhenomanes)和芒孢腐霉(P.aristosporum)的抑制作用,筛选拮抗菌株;通过形态学和分子生物学特性确定Tr21菌株的分类地位;采用常规抑菌方法观察Tr21对腐霉菌丝形态的影响;采用溴化丙啶(PI)染液检测法及对不同处理时间菌丝上清液中蛋白和核酸吸光值的检测,分析Tr21发酵液对腐霉菌细胞膜通透性的影响;通过不同浓度Tr21发酵滤液浸种试验,检测Tr21发酵滤液对玉米种子发芽性状的影响;通过温室盆栽试验和田间人工接种试验,明确Tr21对腐霉茎腐病的防治效果。【结果】从实验室保存的109株木霉菌中,筛选到7株木霉菌对肿囊腐霉、强雄腐霉和芒孢腐霉具有拮抗活性,抑制率均>60%,其中Tr21菌株对3种腐霉菌的抑制率达到100%,其5×、10×和20×稀释液对3种腐霉菌的抑制率均达到100%。50×稀释液对3种腐霉菌的最低抑制率也达到55.56%。经形态学和分子生物学鉴定,Tr21为非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)。显微镜观察显示Tr21发酵滤液能够造成腐霉菌菌丝变粗、菌丝分枝增多、节点缩短、断裂、内含物溢出等畸形现象。PI荧光染色试验显示Tr21发酵滤液导致3种腐霉菌的细胞膜受损,PI染液更易穿透受损的细胞膜进入到菌丝体内,使菌丝染成红色。核酸、蛋白泄露试验发现发酵滤液处理过的菌丝吸光值变化较大,处理5 h后,肿囊腐霉、芒孢腐霉和强雄腐霉菌丝的OD260均增加了0.08,OD280分别增加了0.10、0.11和0.10,表明腐霉菌菌丝细胞膜受损或其完整性被破坏,导致菌丝内含物外溢。不同浓度Tr21发酵滤液对玉米种子的发芽性状无影响,且当Tr21发酵滤液浓度为20×稀释液时对玉米种子的萌发和生长促进效果最好。盆栽试验结果表明,Tr21发酵滤液浓度为5×稀释液时,对3种腐霉茎腐病的室内防治效果最佳,分别为60.67%、63.15%和59.66%。用Tr21的5×稀释液进行种子处理,当药种质量比例为1﹕100时,对腐霉茎腐病的防治效果最高,达82.25%。【结论】获得一株有效防治玉米腐霉茎腐病的木霉菌株Tr21,经鉴定该菌为非洲哈茨木霉,该菌株发酵滤液可导致腐霉菌菌丝畸形、断裂、细胞膜受损、内含物溢出等,是一株具有开发前景的生防微生物。

纤维素降解木霉菌株的筛选及其生物学特性探究

选取分离自河北安国中药材种植基地不同药用植物根区土壤的7株木霉菌,通过羧甲基纤维素钠培养基初筛及玉米秸秆、甘草药渣固态发酵培养基复筛,联合筛选纤维素降解木霉菌株,采用形态学和分子生物学相结合方法进行菌株鉴定,并对其生物学特性进行探究.结果表明,经羧甲基纤维素钠培养基初筛,有4株菌表现出纤维素降解能力,分别为HQ1、BB1、DS3和DS1.经2种木质纤维素底物固态发酵培养基复筛发现,BB1以玉米秸秆为发酵基质时滤纸纤维素酶(filter paper cellulase,FPase)活性最高,HQ1以甘草药渣为基质时FPase活性最高.结合菌落形态、显微结构和DNA分子鉴定,HQ1被鉴定为长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum),BB1为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum).2株菌生物学特性存在趋同性,适宜生长产孢pH为5~6,适宜培养温度为28~33℃,且都表现出抵御干旱胁迫的能力.变差分解表明,不同培养条件对木霉菌生长速率及产孢有重要影响.本实验可为后续进一步优化HQ1和BB1降解不同木质纤维素底物固态发酵培养条件提供依据.