乙酰胆碱受体α4β2亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

通过建立乙酰胆碱受体α4β2亚型(α4β2 nAChR)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,以便以α4β2 nAChR为作用靶点进行药物筛选。将乙酰胆碱受体亚基基因α4、β2体外转录获得的cRNA,通过显微注射的方法注入非洲爪蟾卵母细胞,并对该受体的表达情况进行检测。结果显示,乙酰胆碱受体α4β2亚型在蛙卵细胞中获得了有效表达,记录到典型的ACh配体门控的离子通道内向电流。

非洲爪蟾卵母细胞内源性及外源性ATP和GABA受体介导的膜反应比较

目的 :对非洲爪蟾卵母细胞表达的ATP和GABA激活电流进行比较。方法 :包括mRNA和cDNA的提取、卵母细胞的微量注射及双电极电压钳技术。结果 :①在表达P2X2 或P2X4 的卵母细胞上 ,外加ATP可分别诱导一被Zn2 + 增强的内向电流。②在表达鸡脑mRNA的卵母细胞上 ,可记录到GABA激活电流 ,且此电流可被bicucul line(一种GABAA 受体选择拮抗剂 )所阻断。③在表达了人视网膜 ρ1亚基cRNA的卵母细胞上 ,外加GABA可引起一不被bicuculline阻断的内向电流 ,后者可被I4AA(一种GABAC 受体特异性拮抗剂 )阻断。④在具有滤泡膜的卵母细胞上可记录到 3种形式的ATP激活电流和一外向的慢的GABA激活电流。⑤在除去滤泡膜的卵母细胞上均未记录到ATP和GABA激活电流。结论 :卵母细胞上存在内源性的嘌呤受体、GABAB 和GABAC 受体 ;且此内源性受体存在于滤泡膜上 ;P2X2 、P2X4 嘌呤受体及GABAA 和GABAC 受体均可在卵母细胞上表达 。

非洲爪蟾卵母细胞内的螺旋钙波和靶波

该文应用定态线性化的Atri模型方程,描述非洲爪蟾(XenopusLaevis)卵母细胞内钙波的生成和演化.在忽略细胞边界影响的近似下,得到了爪蟾卵母细胞内螺旋钙波和靶波的解析解.对于远离细胞中心的渐近情形,对应的螺旋波为Archimede型.由此得到的波速、波长和周期均与实验和数值模拟结果吻合.并指出IP3R失活常数必须大于2.43s,才能产生胞内周期钙波.

大鼠背根神经节神经元瞬时外向钾电流与非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2通道电流特性的比较

目的为最终揭示大鼠背根神经节神经元上天然瞬时外向钾通道的结构与功能调节提供依据。方法采用双极电压钳技术记录非洲爪蟾卵母细胞上表达的Kv4.2电流,用全细胞膜片钳技术记录大鼠背根神经节神经元上瞬间外向钾电流(IA),并对二者进行动力学特征的比较。结果背根神经节神经元上IA和Kv4.2通道电流①均具有明显的A型电流特征;②半数最大激活电位分别为(-29.5±3.1)mV和(-3.9±1.0)mV;③半数最大失活电位分别为(-78.5±3.4)mV和(-48.5±0.6)mV;④失活后再激活恢复时间常数(τ)分别为(32.0±4.8)ms和(71.4±13.2)ms。结论Kv4.2通道电流可能是背根神经节神经元上IA电流的主要成分,但不是唯一成分。

非洲爪蟾卵母细胞上内源性ATP及GABA激活电流的比较

实验用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录三磷酸腺苷 (ATP)与γ-氨基丁酸 (GABA)激活电流 ,并对两者进行了比较。结果显示 ,在不同的非洲爪蟾卵母细胞上 ,ATP和 GABA受体分布的种类和数目不同 ;且 ATP和 GABA激活电流均与

受体在非洲爪蟾卵母细胞上表达方法的优化

通过改变非洲爪蟾卵母细胞的消化时间、消化次数、消化用酶量等,优化乙酰胆碱受体的表达条件。结果显示,采用两步消化法,在经过0.5 mg/mL的胶原酶消化50-70 min之后得到的非洲爪蟾卵母细胞的状态较好,利于受体的表达;同时优化了受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达条件。试验所获得的优化表达条件对建立非洲爪蟾卵母细胞受体表达体系具有重要意义。

大鼠脑N-甲基-D-门冬氨酸受体在非洲爪蟾卵母细胞的表达

从成年和14d龄大鼠脑中提取mRNA,并分别注入到非洲爪蟾卵母细胞内,以全细胞电压钳位法测N-甲基-D-门冬氨酸（NMDA）引起内向膜电流,成年组为（5.2±+1.3）nA,14d龄组为（13.3±0.8）nA,组间比较差异显著（P<0.01）;以最小反应模型分析14d龄组的NMDA量效反应曲线呈S形,K值为86μmol/L。结果表明14d龄鼠脑NMDA受体在非洲爪蟾卵母细胞表达较成年鼠好。

α6/α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(α6β4*nAChRs,*代表其他亚基)主要分布于大脑海马区、外周神经节和人源肾上腺嗜铬细胞等,与神经性疼痛和炎症反应、情绪等生理疾病密切相关。本研究拟对大鼠α6/α3β4 nAChR在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞膜上进行重组表达,并利用双电极电压钳电生理学技术检测该重组受体的功能。在不同浓度的激动剂乙酰胆碱的刺激下,比较了α6/α3和β4亚基的不同配比形成的受体通道开放而产生的电流大小,并用其拮抗剂α−芋螺毒素TxID验证了该受体的敏感性。结果表明,亚基不同配比的α6/α3β4 nAChR均可在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,并具有较好的配体门控敏感性。

双(7)-他克林对非洲爪蟾卵母细胞表达的Kv4．2和Kv1．2编码钾通道的作用

目的用非洲爪蟾卵母细胞表达之Kv4.2和Kv1.2编码的快和慢钾通道,检验双(7)-他克林对此两种通道是否有抑制作用。方法应用爪蟾卵母细胞注射mRNA进行表达,电压钳记录Kv4.2和Kv1.2钾电流(IK)。结果双(7)-他克林抑制IK(Kv4.2)和IK(Kv1.2)的IC50值分别为(0.23±0.05)μmol/L和(0.24±0.06)μmol/L。结论此种抑制效应可能与在双(7)-他克林作用下表达的Kv4.2和Kv1.2钾通道激活曲线向超极化电压方向偏移有关。

α6/α3β2β3乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及其条件优化

为建立有效的α6/α3β2β3 nAChRs(α6/α3β2β3,或简写为α6β2*,*代表其他亚基)体外重组表达实验模型,利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系,采用显微注射RNA的方法,利用双电极电压钳技术检测电流,对α6/α3β2β3 nAChRs亚型进行体外重组表达研究,并对其表达条件进行优化,获得了α6/α3β2β3 nAChRs优化的重组表达体系.烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是一类重要的配体门控离子通道,其亚型众多且结构相似,但各亚型的生理学和药理学功能截然不同.天然的α6β2*nAChRs很难体外表达,体外表达模型的表达电流非常小.因此,本实验拟研究优化该亚型的表达,进行优化后的体外表达模型,产生的激发电流显著提高,为以该亚型为靶点的新药筛选提供实验模型和基础.

非洲爪蟾卵母细胞P2X受体存在的证明

目的D1中除有P2Y受体介导的成分外,可能还有P2X受体介导的电流参与。本研究的目的在于进一步证实D1电流中是否有P2X受体介导电流的存在。方法采用双电极电压钳记录方法。结果Zn2+对不依赖于G蛋白之IATP(D1)具有增强作用;重复施加ATPD1电流逐步减小,而D2电流则逐步增大。在仅有D2之IATP(D2)情况下,重复加ATP后D2电流不但不增大反而有所下降。结论非洲爪蟾卵母细胞上存在P2X受体。

不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响

目的研究不同偶联模式的兴奋性氨基酸受体所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的相互影响。方法用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,通过全细胞双电极电压钳位法,分别以M-胆碱受体Carb,谷氨酸离子型受体激动剂kainate(KA),代谢Ⅰ型受体激动剂quisqualate(QA)及代谢Ⅲ型受体激动剂L-phosphoserine(L-SOP)两两同时灌流有受体表达的非洲爪蟾卵母细胞。结果3种偶联模式的受体激动后产生的膜电流具有交叉脱敏现象。结论在多种受体共存的细胞中,受体之间可能存在着广泛的相互作用。

非洲爪蟾卵母细胞表达系统中N-型电压门控钙离子通道新药筛选模型的建立与优化

N-型电压门控钙离子(Ca^(2+))通道(N-type voltage-gated calcium channel,N-type VGCC,Ca_(V)2.2)在突触前末端响应动作电位介导Ca^(2+)内流,并在突触发生、神经递质释放和伤害性信号传递中发挥重要作用,是神经痛(慢性痛)等重大疾病治疗药物研发的关键靶点。由于钙离子通道体外表达困难,通道电流检测技术复杂,其新药筛选模型极其缺乏。因此,本研究利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统,进行Ca_(V)2.2体外重组表达,建立电生理学技术药物筛选模型,并对该表达技术体系进行了优化(本研究获得广西大学伦理委员会审查批准,批准号:GXU-2023-0249)。首先,以大鼠Ca_(V)2.2的主亚基α1B及其辅助亚基α2δ1和β3的cDNA基因为模板,分别在体外进行转录,人工合成了Ca_(V)2.23个亚基的mRNA(cRNA),按照2∶1∶1的质量比混合,将3种cRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行表达。随后使用双电极电压钳技术检测Ca_(V)2.2离子通道是否产生细胞膜内向电流,同时对各个表达条件进行了优化,从通道的激活、失活等方面表征了其门控功能。结果显示,在cRNA显微注射后的第3~5天,使用四乙基氢氧化铵(TEAOH)和1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四酯(BAPTA-AM)处理,可分别消除内源性钾离子通道和Ca^(2+)激活的氯离子通道干扰,成功检测到稳定的Ca_(V)2.2介导的钡离子电流。Ca_(V)2.2的最大激活膜电位为0 mV,当膜电位大于+50 mV时会出现电流方向反转。通过拟合稳态激活和失活曲线获知Ca_(V)2.2的半激活电位和半失活电位分别为-15.9和-60.2 mV。本研究基于非洲爪蟾卵母细胞,通过条件优化,建立了稳定的Ca_(V)2.2表达系统。该体外表达系统可以为靶向Ca_(V)2.2活性化合物或先导药物的筛选提供新的途径。

α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达

建立以哺乳动物α3β4乙酰胆碱受体(nAChR)为分子靶标的药物筛选模型。将大鼠乙酰胆碱受体的α3与β4亚基基因分别进行体外转录,获得α3与β4亚基基因的cRNA,按1∶1的比例将适量α3与β4的cRNA混合后,显微注射到新鲜分离的非洲爪蟾卵母细胞中,在ND96溶液中、17℃下培养24 h后,通过双电极电压钳技术(TEVC)检测受体α3β4 nAChR的乙酰胆碱(Ach)门控电流。同时注入α3、β4 cRNA的非洲爪蟾卵母细胞孵育24h后,可记录到明显的Ach门控内向电流,未注射或只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生。α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,以此为药物作用靶点,可用于大量生物毒素等物质的活性筛选实验模型。

肌肉型乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

建立肌肉型乙酰胆碱受体(胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε)在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型,用于以这两种受体为靶点的药物筛选。将肌肉型乙酰胆碱受体的各个亚基基因在体外转录获得各自的cRNA,显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中,利用双电极电压钳技术检测其表达情况,并确定不同浓度的乙酰胆碱对胎儿型α1β1δγ和成年型α1β1δε受体电流表达情况的影响。在卵母细胞中成功表达两种肌肉型乙酰胆碱受体;当乙酰胆碱浓度为1μmol/L时,α1β1δγ和α1β1δε受体电流很小,不能用于后续的检测试验,当浓度为5μmol/L时,完全激活α1β1δγ受体的开放电流达到最大6025 nA,当浓度为20μmol/L时,完全激活α1β1δε受体的开放电流达到最大2 742 nA,只注射ddH2O的对照组细胞则没有任何电流产生。该受体模型的成功建立,为筛选作用于肌肉型乙酰胆碱受体的药物提供了实验模型。

非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用

目的 当前人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移。而基因功能的研究离不开基因的表达 ,这就迫切需要一种操作简便 ,适用范围广的表达工具来表达有功能的蛋白质。方法 非洲爪蟾注射HCG催卵 ,2 %半胱氨酸去胶膜 ,高速离心制备卵提取物 ,即为非洲爪蟾卵非细胞翻译体系。通过亚克隆技术将TFAR1 9基因克隆到体外转录质粒中 ,通过酶切线性化模板 ,体外转录 ,加帽合成cRNA ,将其加入到制备的蛙卵提取物中进行体外翻译。结果 用Westernblot鉴定 ,获得了高效翻译 ,并且加入亚精胺和ATP再生系统可以提高翻译的效率。

大鼠胆碱酯酶mRNA在卵母细胞中的表达

ＡＧＰＣ法是一种快速、简便、有效的ＲＮＡ提取方法。参照该法自新生大鼠脑组织中提取出总ＲＮＡ，进一步通过ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）－纤维素亲和层析分离获得ｐｏｌｙ（Ａ）￣＋ＲＮＡ。当ｐｏｌｙ（Ａ）￣＋ＲＮＡ或总ＲＮＡ经显微注射法进入非洲爪蟾卵母细胞后，其翻译系统能够利用外源ｍＲＮＡ合成具有催化活性的胆碱酯酶。表达的胆碱酯酶大部分分泌到卵母细胞培养液中。在一定范围内，ｍＲＮＡ的注射量与胆碱酯酶的表达量成正比。所合成的胆碱酯酶活性可被毒扁豆碱和Ｓ－（２－二异丙基氨乙基）甲基硫赶膦酸乙酯（ＶＸ）抑制。

兴奋性氨基酸受体所介导细胞钙电流特征及其中L-SOP的作用途径

目的:研究兴奋性氨基酸受体各亚型所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的特征及其中Ⅲ型受体激动剂L-SOP的作用途径。方法:用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,以全细胞双电极电压钳位法灌流此卵母细胞。结果:100μM KA(kainate)(离子型)产生一主峰电流后缓慢下行,成为一稳定电流平台,最终脱敏,脱敏时间平均为37.57 min。2 txM QA(quisqualate)(代谢Ⅰ型)产生一峰值电流后转为一持续性钙振荡或直接出现钙振荡,振荡维持时间为(6.72±1.33)min,脱敏时间均随激动剂浓度的增加而缩短。0.8 mM L- SOP(L-phosphoserine)(代谢Ⅲ型)灌流产生规律性电流振荡,振荡时间为(20.17±8.47)min。此振荡电流可被代谢Ⅰ型受体拮抗剂L-AP_3所拮抗。结论:离子型、代谢Ⅰ型及代谢Ⅲ型受体均产生各自特征电流模型;L-SOP不仅是Ⅲ型受体的激动剂,而且是Ⅰ型受体的弱的激动剂,即细胞振荡电流是L-SOP通过Ⅰ型受体的作用途径而产生。

稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2电生理特性的影响

目的探讨稳心颗粒对人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道2（HCN2）电生理特性的影响。方法将人HCN2的mRNA注射到非洲爪蟾卵母细胞，孵育1～2天后，采用双电极电压钳技术观察0．5，1，2，4g／L稳心颗粒对HCN2通道电流的作用。结果①测试电位－90mV时，0．5，1，2，4g／L稳心颗粒分别使HCN2瞬时电流增加17．74％±6．04％，49．26％±8．74％，86．05％±16．15％和124．38％±11．62％，瞬时电流增加50％的药物浓度（EC50）为1．54±0．24g／L（n=8）。②在测试电位-140mV到-100mV水平上，2g/L稳心颗粒延长HCN2通道激活时间常数：（226．74±31．37ms vs143．68±21．45ms；-140mV，n=10，P〈0．05）③2g／L稳心颗粒延长HCN2通道去激活时间常数（1293．54±95．03ms vs647．13±61．36ms；-140mV，n=10，P〈0．05）。结论稳心颗粒呈浓度依赖性增强HCN2瞬时电流，减缓通道激活和去激活过程。

四种心肌克隆钾通道的表达和电生理记录

为建立一种研究离子通道的有效模型 ,笔者应用分子生物学技术 ,将包含有Kv1.4、Kv1.5、Herg和KvLQT1等几种心肌克隆钾离子 (K+ )通道cDNA的质粒经扩增 ,提取 ,以及纯化后转录为mRNA。经微注射技术分别将它们注射入克隆离子通道表达系统———非洲爪蟾卵母细胞内 ,然后应用膜片钳技术记录上述克隆离子通道电流。结果 :获得了四种克隆通道的电流 时间关系曲线 (I/t)和电流 电压关系曲线 (I/V)。结论 :本实验结果证明所采用的技术稳定可靠 ,并为今后开展克隆离子通道结构和功能的关系以及抗心律失常药物与离子通道相互作用的研究提供了坚实的基础。