PRRSV非结构蛋白Nsp1α合成肽多克隆抗体的制备及应用

本研究尝试利用PRRSV Nsp1α合成肽进行多克隆抗体的制备,并对抗体的特性进行了分析。首先,利用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp1α的抗原肽序列;随后,按照此序列合成获得抗原肽,并将其与KLH载体蛋白进行偶联;接下来,将偶联好的抗原肽与弗氏佐剂混合,通过免疫大白兔制备针对Nsp1α合成肽的多克隆抗体;最后,利用ELISA、Western blot及间接免疫荧光法对多克隆抗体的特性进行了分析。结果显示:该多克隆抗体ELISA的效价超过105;利用Western blot可以检测到特异的Nsp1α表达条带,包括瞬时转染的样品和不同毒株病毒感染的样品;利用间接免疫荧光法分析,该多克隆抗体可有效地区分病毒感染和未感染的样品。结果表明,PRRSV Nsp1α合成肽多克隆抗体可以有效地应用于PRRSV Nsp1α表达检测,为进一步研究PRRSV Nsp1α的功能提供了一个有效的工具。

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。

E3泛素连接酶三结构域蛋白59对非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨三结构域蛋白59(TRIM59)对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法将非小细胞肺癌细胞系A549分为siControl组、siTRIM59组、Flag-Vector组和Flag-TRIM59组,用CCK-8实验检测细胞增殖活力;用TUNEL染色实验检测细胞凋亡率;用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;用蛋白质免疫印记实验检测AKT表达水平和磷酸化水平。结果与siControl组相比,siTRIM59组细胞增殖活力下降(P<0.05),凋亡比例升高(P<0.05),细胞迁移率降低(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数减少(P<0.05),AKT磷酸化水平下降。与Flag-Vector组相比,Flag-TRIM59组细胞增殖活力增强(P<0.05),凋亡比例降低(P<0.05),细胞迁移率升高(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数增加(P<0.05),AKT磷酸化水平上升。结论TRIM59促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及AKT的磷酸化。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中非结构蛋白Nsp2表达分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)非结构蛋白Nsp2对病毒复制和致病具有重要作用,本研究旨在分析Nsp2在Marc-145细胞内的分布与表达。构建nsp2含PL2区域基因片段的原核表达载体,重组蛋白纯化后作为免疫抗原,制备Nsp2特异性单克隆抗体。将携带nsp2基因的真核表达载体转染至Marc-145及HEK293细胞,或将PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间点收集细胞样品。免疫荧光观察Nsp2在转染细胞中的亚细胞定位,免疫印迹分析Nsp2在真核细胞中的表达。筛选获得了1株稳定分泌特异性抗Nsp2的单克隆杂交瘤细胞株,能用于免疫荧光和印迹分析。重组真核表达质粒转染Marc-145与HEK293细胞后,Nsp2主要定位于细胞质中,免疫印迹检测到约为120与50ku的蛋白条带。PRRSV感染Marc-145细胞4h即可检测到Nsp2的表达,主要定位于细胞核周围,随着感染时间延长Nsp2分布范围逐渐扩大至整个细胞质。病毒感染8h,可检测到120ku左右的Nsp2蛋白条带,感染后12h可检测到70和50ku左右的Nsp2蛋白,且蛋白表达量随感染时间延长显著增多。PRRSV感染细胞中Nsp2的表达与剪切分析,为深入研究该蛋白在病毒复制和致病中的功能奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段。将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coliBL21(DE3)细胞。经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%。Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。

SARS冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性

SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性.实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15(DeISGylation)活性.研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro.但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性.SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础.

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP4细胞核定位研究

为探讨PRRSV非结构蛋白4(NSP4)功能,体外构建了pEGFP-N1-nsp4真核表达载体,转染Marc-145细胞,利用NSP4-GFP融合蛋白携带的绿色荧光标记,研究NSP4蛋白在Marc-145细胞中的定位,并根据蛋白疏水性设计构建含有nsp4基因N端不同长度的重组pEGFP-N1表达载体,转染细胞以进一步了解NSP4蛋白是否存在核定位信号序列及其在细胞中的分布。试验结果表明:融合蛋白主要位于细胞核,部分在胞浆内。PRRSV NSP4蛋白铰链区(hinge region,HR)145～168氨基酸是决定蛋白核内定位的功能区,该片段缺失影响NSP4蛋白进入细胞核。结论:体外转染细胞内表达的NSP4蛋白主要分布在细胞核内,HR区是其核定位信号,NSP4蛋白通过HR区信号作用主动进入细胞核内。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp11结构与功能

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种严重危害生猪养殖的重要病原,以引起感染母猪繁殖障碍和各日龄猪只呼吸道症状为特征。PRRSV病原具有免疫抑制、持续性感染和高度变异的特性,其在靶细胞（PAMs）中或体内的增殖能力能够直接影响病毒的致病性,而病毒编码的非结构蛋白（nsp）往往与病毒复制增殖能力密切相关。

人轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

目的 :初步了解重症腹泻轮状病毒株NSP4基因特征及变异情况 .方法 :在 2 0 0 2年 10 0例秋冬季腹泻患儿轮状病毒分子流行特征的研究中 ,确诊为轮状病毒腹泻的 10例患儿的粪便标本 ,用PCR方法对其NSP4基因进行测定 ,并挑选出一株重症腹泻轮状病毒毒株 (简称 0 2′K1) ,采用一步法RT -PCR对其NSP4基因进行扩增获得NSP4cDNA ,利用银染测序方法对所扩增获得NSP4cDNA进行测定 .采用Winegene2 31核酸分析软件对 0 2′K1株NSP4核苷酸序列进行翻译 ,同时利用Omiga生物软件对 0 2′K1株、ST3株 (人轮状病毒G4血清型 )及代表NSP4四个主要基因型的之一的Wa株 (简称Wa - 1株 )、Wa -a株、Wa -v株的核苷酸和氨基酸序列进行比较 ,分析其同源性及 0 2′K1株的NSP4氨基酸变异位点 .结果 :(1)经一步法RT -PCR扩增获得的NSP4cDNA约 72 5bp ,NSP4基因全长 6 86个核苷酸 ,含有一个开放读码框架 ,编码一个由175个氨基酸组成的蛋白 ;(2 ) 0 2′K1株与ST3株、Wa - 1株、Wa -a株、Wa -v株的核苷酸和氨基酸同源性均达 90 %以上 ;(3)与ST3比较 ,0 2′K1株的NSP4氨基酸序列有 14个位点发生了变异 ,即aa16、aa2 6、aa6 0、aa72、aa76、aa12 4、aa135、aa14 0、aa14 1、aa 14 5、aa14 6、aa16 1、aa16 2、aa16 9.结论 :(1) 0 2′K1株?

轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展

轮状病毒 (rotavirus,RV)是病毒性腹泻的主要病因。NSP4 (nonstructural protein4 )作为轮状病毒的一种非结构蛋白 ,在病毒形态发生和致病性中发挥重要作用 ,近年来日益受到重视。本文就 NSP4的研究进展作一综述。

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp5在真核细胞中的重组表达及鉴定

本文以嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得IBV非结构蛋白5(non-structural protein,nsp5)基因片段后,构建了杆状病毒重组质粒IBVnsp5-Bacmid。IBVnsp5-Bacmid转染Sf9细胞,获得nsp5重组杆状病毒,经(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot检测到转染细胞表达的nsp5蛋白。进一步从感染的细胞中纯化重组蛋白,并用纯化的蛋白免疫小鼠制备了抗nsp5的多抗血清,该多抗血清可检测到IBV四川株SC021202感染的DF-1细胞中特异性的nsp5蛋白。结果表明IBV nsp5在Bac-to-Bac真核表达系统中获得了成功表达,而且具有良好的免疫原性和反应原性。

非洲猪瘟病毒蛋白质结构和功能的研究进展

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的高致病性、出血性猪传染病,急性感染死亡率高达100%。ASFV是一种双链DNA病毒,编码蛋白超过150种,其中结构蛋白50多种,非结构蛋白100多种。本文对近年来ASFV蛋白质结构和功能相关研究进行了梳理,讨论了在病毒感染、组装、DNA复制、宿主细胞代谢调控和免疫逃逸等过程中发挥关键作用的结构蛋白和非结构蛋白,分析了ASFV蛋白质在病毒生命周期中扮演的角色和多种蛋白质之间相互作用,以期为未来针对非洲猪瘟的预防和治疗提供参考。

盖塔病毒非结构蛋白NSP1多克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体,用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因,构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了NSP1蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10^(5)以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示,NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备,为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。

辛德毕斯病毒非结构蛋白nsP2在细胞内的分布

应用免疫电镜技术,直观地显示出辛德毕斯病毒的nsP2蛋白存在于细胞核中以及它在核内的分布.将含有nsP2蛋白的一段SbV的cDNA转染细胞,结果表明,单独表达的nsP2仍可进入细胞核中.

非变性质谱和紫外激光解离在蛋白质结构和相互作用分析中的应用

蛋白质结构及相互作用的动态变化与其生物学功能密切相关,对蛋白质结构及相互作用进行精准探测和分析面临着巨大挑战。非变性质谱(nMS)是一种能够在近生理条件下将蛋白质及其复合物通过电喷雾离子化引入气相离子并进行质谱分析的方法。通过直接测定溶液中蛋白质及其复合物的组成或整合多种质谱解离技术,nMS可获取蛋白质及其复合物的计量关系、组装形式、解离常数、构象变化、结合界面及作用位点等关键信息,以揭示蛋白质相互作用与生物学功能之间的关系。紫外激光解离(UVPD)技术,特别是采用了193 nm准分子激光的UVPD是近年来迅速发展起来的质谱解离技术,其可以高效解离非变性蛋白质骨架,并保留碎片离子中的氢键等非共价相互作用力,从而实现单氨基酸位点分辨的蛋白质动态结构和相互作用质谱解析。本综述主要介绍了nMS和UVPD技术在蛋白质动态结构和相互作用分析中的应用和最新进展,包括由位点突变及配体结合等引起的蛋白质动态结构和相互作用变化,最后对蛋白质nMS表征的未来发展方向做出了展望。

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

肝细胞DEP结构域蛋白5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号轴在非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的建立肝细胞Dishevelled/Egl-10/pleckstrin(DEP)结构域蛋白5(DEPDC5)基因(Depdc5)肝细胞特异性敲除小鼠高脂喂养模型,探讨DEPDC5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号轴对非酒精性脂肪肝的调控。方法构建肝细胞特异性敲除Depdc5^(flox/flox)模型;Alb-Cre小鼠(LKO),Depdc5^(flox/flox)小鼠(Loxp)作为对照。32只2~3月龄雄性小鼠随机分为高脂LKO组、高脂Loxp对照组、高脂+雷帕霉素LKO组及高脂+雷帕霉素Loxp对照组,每组8只。检测肝脏血清生物化学指标、脂质含量、蛋白、mRNA及病理切片,采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果高脂喂养导致LoxP小鼠肝脏脂肪变性,LKO小鼠肝脏脂肪变性减轻但合并出现肝损伤;雷帕霉素抑制了Depdc5敲除引起的mTORC1通路激活,显著改善Loxp小鼠肝脏脂肪变性,并改善LKO小鼠的肝损伤。结论Depdc5基因敲除能够保护高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性,雷帕霉素可以改善DEPDC5缺失诱发的肝损伤。

SARS-CoV-2非结构蛋白NSP14的生物信息学分析

目的:通过生物信息学手段预测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中非结构蛋白NSP14的性质特征。方法:以SARS-CoV-2的NSP14氨基酸序列为研究对象,通过Blastp与SARS-CoV的NSP14进行比对,并利用ProtParam、ProtScale、PredictProtein和SWISS-MODEL等生物信息学软件工具对NSP14的理化性质、结构和活性区域等进行预测。结果:SARS-CoV-2的NSP14由527个氨基酸残基构成,是一种可溶性亲水蛋白,与SARS-CoV中NSP14氨基酸序列的一致率达到95%。NSP14二级结构中无规则卷曲含量最高,该蛋白质包含了N-糖基化位点、cAMP或cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点等5个保守基序。NSP14同时具备N端核糖核酸外切酶和N7-甲基转移酶2个结构域,其活性区域的总面积和体积分别为1469.712?~2和1708.967?~3。结论:基于SARS-CoV-2中NSP14的氨基酸序列,运用生物信息学相关软件分析和预测了NSP14蛋白的性质和结构,为新型冠状病毒疫苗研制和药物筛选提供理论依据。

非小细胞肺癌组织三结构域蛋白21和白细胞分化抗原147表达及意义

目的:探究非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌及癌旁组织标本中三结构域蛋白21(TRIM21)和白细胞分化抗原147(CD147)表达及意义。方法:选取接受手术治疗的NSCLC患者126例,采集癌及癌旁组织,分别定义为NSCLC组和癌旁组。分析TRIM21、CD147在癌和癌旁组织中的表达情况,探究两者与临床病理特征的关系。随访1年,分析存活组与病死组TRIM21、CD147的表达差异。结果:NSCLC组TRIM21阳性表达率低于癌旁组,CD147阳性表达率高于癌旁组(均P<0.05)。在组织分化、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征方面,TRIM21和CD147阳性率比较差异有统计学意义(均P<0.05)。在NSCLC患者中,TRIM21表达与CD147表达呈现负相关,且两者与淋巴结转移、TNM分期及组织分化具有相关性(均P<0.05)。随访结果显示,126例NSCLC患者中,有55例患者病死(病死组),71例患者存活(存活组)。存活组TRIM21阳性表达率高于病死组,CD147阳性表达率低于病死组(均P<0.05)。结论:NSCLC患者癌组织TRIM21表达降低而CD147表达升高,均与组织分化、淋巴结转移、TNM分期及预后相关。

乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用

【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。