鸭坦布苏病毒非结构蛋白亚细胞定位及其在IFN-β信号通路中的作用

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白的亚细胞定位及其在β-干扰素(IFN-β)信号通路中的作用。【方法】通过RT-PCR法扩增DTMUV的7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS-HA,构建重组真核表达质粒,并分别转染至HEK-293T细胞,通过Western blotting检测蛋白表达;利用间接免疫荧光试验检测非结构蛋白的亚细胞定位情况,通过双荧光素酶报告试验研究DTMUV的非结构蛋白对鸭源IFN-β启动子活性的影响。【结果】试验成功构建DTMUV的7个非结构蛋白带HA标签的真核表达质粒。Western blotting结果显示,真核表达非结构蛋白均正常表达,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白分子质量大小分别为38、25、14.4、68、13.9、28和100 ku。间接免疫荧光试验结果显示,7个非结构蛋白在细胞内的表达形态不一,主要定位在细胞浆中。双荧光素酶报告试验结果表明,与对照组相比,过表达NS2B和NS4B蛋白后,鸭源IFN-β启动子活性极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了DTMUV的7个非结构蛋白的真核表达质粒,非结构蛋白主要表达于细胞浆中,其中NS2B和NS4B蛋白具有颉颃IFN-β活性的功能。试验结果为DTMUV的免疫逃逸研究提供了一定的理论依据,并为深入探究DTMUV在宿主天然免疫信号通路中的作用机制提供了试验材料。

E3泛素连接酶三结构域蛋白59对非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨三结构域蛋白59(TRIM59)对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法将非小细胞肺癌细胞系A549分为siControl组、siTRIM59组、Flag-Vector组和Flag-TRIM59组,用CCK-8实验检测细胞增殖活力;用TUNEL染色实验检测细胞凋亡率;用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;用蛋白质免疫印记实验检测AKT表达水平和磷酸化水平。结果与siControl组相比,siTRIM59组细胞增殖活力下降(P<0.05),凋亡比例升高(P<0.05),细胞迁移率降低(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数减少(P<0.05),AKT磷酸化水平下降。与Flag-Vector组相比,Flag-TRIM59组细胞增殖活力增强(P<0.05),凋亡比例降低(P<0.05),细胞迁移率升高(P<0.05),侵袭到Transwell下层小室的细胞数增加(P<0.05),AKT磷酸化水平上升。结论TRIM59促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,以及AKT的磷酸化。

番茄斑萎病毒属病毒非结构蛋白NSs的生物信息学分析

番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒编码的非结构蛋白NSs,可能在病毒复制、转录、抑制RNA沉默中起重要作用,本文利用生物信息方法对21个Tospovirus病毒成员的NSs序列进行分析,为进一步研究NSs的功能提供参考信息。从GenBank数据库中下载NSs基因序列,用DNAMAN5.0做NSs相似性矩阵分析,发现一些Tospovirus病毒成员之间的NSs氨基酸序列相似性很低,最低仅为7.1%;用ClustalX2.1进行NSs的氨基酸多序列比对分析,发现Tospovirus病毒成员的NSs相对保守区主要位于NSs的C端的位置,高度保守的氨基酸位点共有9个;PROSITE对NSs进行模体预测分析,结果显示Tospovirus病毒NSs共有的蛋白修饰:C蛋白激酶磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化和N-酰基化。此外,不同种的Tospovirus病毒NSs模体也表现出了多样性的特点。预测结果为下一步研究NSs功能奠定了基础。

番茄环纹斑点病毒非结构蛋白NSs的原核表达及多抗血清制备

用RT-PCR从感染番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)的番茄中扩增出编码病毒非结构蛋白NSs基因,将NSs基因构建到原核表达载体p ET-30 a中,获得原核表达载体p ET-30a-NSs,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDSPAGE电泳分析显示,高效诱导表达了57k Da融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/8192。用制备好的抗血清对TZSV感病病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清可用于TZSV的检测,并为进一步研究NSs功能奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。

非洲猪瘟病毒蛋白质结构和功能的研究进展

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的高致病性、出血性猪传染病,急性感染死亡率高达100%。ASFV是一种双链DNA病毒,编码蛋白超过150种,其中结构蛋白50多种,非结构蛋白100多种。本文对近年来ASFV蛋白质结构和功能相关研究进行了梳理,讨论了在病毒感染、组装、DNA复制、宿主细胞代谢调控和免疫逃逸等过程中发挥关键作用的结构蛋白和非结构蛋白,分析了ASFV蛋白质在病毒生命周期中扮演的角色和多种蛋白质之间相互作用,以期为未来针对非洲猪瘟的预防和治疗提供参考。

PRRSV非结构蛋白Nsp1α合成肽多克隆抗体的制备及应用

本研究尝试利用PRRSV Nsp1α合成肽进行多克隆抗体的制备,并对抗体的特性进行了分析。首先,利用生物信息学技术预测获得PRRSV非结构蛋白Nsp1α的抗原肽序列;随后,按照此序列合成获得抗原肽,并将其与KLH载体蛋白进行偶联;接下来,将偶联好的抗原肽与弗氏佐剂混合,通过免疫大白兔制备针对Nsp1α合成肽的多克隆抗体;最后,利用ELISA、Western blot及间接免疫荧光法对多克隆抗体的特性进行了分析。结果显示:该多克隆抗体ELISA的效价超过105;利用Western blot可以检测到特异的Nsp1α表达条带,包括瞬时转染的样品和不同毒株病毒感染的样品;利用间接免疫荧光法分析,该多克隆抗体可有效地区分病毒感染和未感染的样品。结果表明,PRRSV Nsp1α合成肽多克隆抗体可以有效地应用于PRRSV Nsp1α表达检测,为进一步研究PRRSV Nsp1α的功能提供了一个有效的工具。

非变性质谱和紫外激光解离在蛋白质结构和相互作用分析中的应用

蛋白质结构及相互作用的动态变化与其生物学功能密切相关,对蛋白质结构及相互作用进行精准探测和分析面临着巨大挑战。非变性质谱(nMS)是一种能够在近生理条件下将蛋白质及其复合物通过电喷雾离子化引入气相离子并进行质谱分析的方法。通过直接测定溶液中蛋白质及其复合物的组成或整合多种质谱解离技术,nMS可获取蛋白质及其复合物的计量关系、组装形式、解离常数、构象变化、结合界面及作用位点等关键信息,以揭示蛋白质相互作用与生物学功能之间的关系。紫外激光解离(UVPD)技术,特别是采用了193 nm准分子激光的UVPD是近年来迅速发展起来的质谱解离技术,其可以高效解离非变性蛋白质骨架,并保留碎片离子中的氢键等非共价相互作用力,从而实现单氨基酸位点分辨的蛋白质动态结构和相互作用质谱解析。本综述主要介绍了nMS和UVPD技术在蛋白质动态结构和相互作用分析中的应用和最新进展,包括由位点突变及配体结合等引起的蛋白质动态结构和相互作用变化,最后对蛋白质nMS表征的未来发展方向做出了展望。

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。

肝细胞DEP结构域蛋白5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号轴在非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的建立肝细胞Dishevelled/Egl-10/pleckstrin(DEP)结构域蛋白5(DEPDC5)基因(Depdc5)肝细胞特异性敲除小鼠高脂喂养模型,探讨DEPDC5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号轴对非酒精性脂肪肝的调控。方法构建肝细胞特异性敲除Depdc5^(flox/flox)模型;Alb-Cre小鼠(LKO),Depdc5^(flox/flox)小鼠(Loxp)作为对照。32只2~3月龄雄性小鼠随机分为高脂LKO组、高脂Loxp对照组、高脂+雷帕霉素LKO组及高脂+雷帕霉素Loxp对照组,每组8只。检测肝脏血清生物化学指标、脂质含量、蛋白、mRNA及病理切片,采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果高脂喂养导致LoxP小鼠肝脏脂肪变性,LKO小鼠肝脏脂肪变性减轻但合并出现肝损伤;雷帕霉素抑制了Depdc5敲除引起的mTORC1通路激活,显著改善Loxp小鼠肝脏脂肪变性,并改善LKO小鼠的肝损伤。结论Depdc5基因敲除能够保护高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性,雷帕霉素可以改善DEPDC5缺失诱发的肝损伤。

非小细胞肺癌组织三结构域蛋白21和白细胞分化抗原147表达及意义

目的:探究非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌及癌旁组织标本中三结构域蛋白21(TRIM21)和白细胞分化抗原147(CD147)表达及意义。方法:选取接受手术治疗的NSCLC患者126例,采集癌及癌旁组织,分别定义为NSCLC组和癌旁组。分析TRIM21、CD147在癌和癌旁组织中的表达情况,探究两者与临床病理特征的关系。随访1年,分析存活组与病死组TRIM21、CD147的表达差异。结果:NSCLC组TRIM21阳性表达率低于癌旁组,CD147阳性表达率高于癌旁组(均P<0.05)。在组织分化、淋巴结转移及TNM分期等临床病理特征方面,TRIM21和CD147阳性率比较差异有统计学意义(均P<0.05)。在NSCLC患者中,TRIM21表达与CD147表达呈现负相关,且两者与淋巴结转移、TNM分期及组织分化具有相关性(均P<0.05)。随访结果显示,126例NSCLC患者中,有55例患者病死(病死组),71例患者存活(存活组)。存活组TRIM21阳性表达率高于病死组,CD147阳性表达率低于病死组(均P<0.05)。结论:NSCLC患者癌组织TRIM21表达降低而CD147表达升高,均与组织分化、淋巴结转移、TNM分期及预后相关。

乙型脑炎病毒非结构蛋白的表达及与hnRNP K的相互作用

【目的】为探明JEV病毒复制与宿主蛋白的关系。【方法】首先构建非结构蛋白质粒,然后将构建成功的非结构蛋白的质粒转染至Vero细胞中,24 h在荧光显微镜下观察蛋白表达情况,再分别与pCMV-MYC-hnRNP K质粒同时转染至Vero细胞中,培养24 h,收取细胞蛋白样,进行Co-IP试验相关步骤,用Western-blot实验进行结果呈现,得出试验结果。【结果】构建的非结构蛋白质粒在Vero细胞中可以表达,通过与表达hnRNP K蛋白的质粒共转染,通过Co-IP试验经Western-blot结果分析能够得出JEV的NS1与hnRNP K之间存在相互作用,JEV的NS2a、NS3、NS5与宿主hnRNP K之间不存在相互作用。【结论】JEV的NS1蛋白与宿主蛋白hnRNP K存在相互作用,为JEV非结构蛋白的研究进一步拓宽了思路,同时为JEV病毒在宿主细胞中的生命活动周期的研究提供了基础,为深入研究JEV病毒复制提供了新方向。

发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白的表达和定位及宿主互作蛋白的筛选和分析

目的:通过免疫沉淀联合质谱分析的方法筛选发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)非结构蛋白(NSs)的宿主互相作用(互作)蛋白,探讨互作蛋白的功能、亚细胞定位及参与的生物途径,为阐明SFTSV的复制和致病机制提供依据。方法:将真核表达载体pSFTSV-NSs-Flag (实验组)和Flag-CMV-3 (阴性组)分别转染进人胚胎肾293T细胞中,同时设置空白组(不进行任何处理)。收集各组细胞裂解液,采用间接免疫荧光和Western blotting法验证SFTSV NSs在宿主细胞中的表达及定位。蛋白裂解液经protein A/G处理,采用免疫沉淀法富集与NSs结合的宿主蛋白,通过银染和考马斯亮蓝染色初步分析捕获的互作蛋白,观察各组蛋白差异条带。采用液相色谱和串联质谱技术得到蛋白质的序列信息,保留可信蛋白基于UniProt数据库检索,对鉴定到的蛋白进行基因本体论(GO)功能富集分析、蛋白结构域和功能位点数据库(IPR)、真核生物同源蛋白簇(KOGs)功能注释、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析、亚细胞定位和转录因子(TF)功能注释,确定互作蛋白的亚细胞结构、基因功能及参与的生物过程。结果:SFTSV NSs在相对分子质量33 000处表达单一特异性条带,免疫荧光检测其定位于细胞质中,且聚集呈砂粒体包涵体样。银染和考马斯亮蓝染色,实验组和阴性组均存在显著差异条带。质谱筛选出46种潜在互作蛋白;GO功能富集分析、KOGs功能注释和KEGG信号通路富集分析,与病毒翻译、细胞代谢及蛋白质运输相关的生物途径富集到较多数目的蛋白,注释中有8种蛋白具有中间丝蛋白结构域。亚细胞定位所占百分率最高的是细胞质蛋白;与NSs定位场所一致。TF功能注释,有1种蛋白来自NF-Y家族。结论:互作蛋白在协助蛋白质正确折叠、参与核糖体翻译和构成细胞骨架等进程中发挥作用,可能参与了抗病毒复制,可作为候选蛋白进一步研究SFTSV的复制机制。

猪流行性腹泻病毒非结构蛋白NSP15抑制细胞焦亡的分子机制研究

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)及其NSP15蛋白对细胞焦亡的影响及初步的分子作用机制,本研究将表达pGSDMD-p30的质粒转染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2细胞),24 h后将PEDV感染该细胞,于感染后12 h和24 h分别收集细胞上清液和细胞,采用LDH试剂盒测定各时间点细胞上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放比例;采用qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,各时间点,转染表达pGSDMD-p30质粒的IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均极显著升高,表明细胞发生焦亡,且与转染p GSDMD-p30质粒的细胞相比,PEDV感染的细胞中LDH的释放比例及GSDMD mRNA的转录水平均极显著降低。将表达pGSDMD-p30的质粒分别与不同剂量的PEDV-NSP15质粒共转染HEK293T细胞(pGSDMD-p30+NSP15组);将表达Caspase-1、pGSDMD和表达NSP15的质粒分别共转染HEK293T和IPEC-J2细胞(Caspase-1+pGSDMD+NSP15组)。上述细胞于24 h后均测定各组细胞上清液中LDH的释放比例。结果显示,与pGSDMD-p30组(共转染表达pGSDMD-p30与空载体的细胞)相比,pGSDMD-p30+NSP15组HEK293T细胞及IPEC-J2细胞中LDH的释放比例均显著降低;与Caspase-1+pGSDMD对照组细胞相比,Caspase-1+pGSDMD+NSP15组细胞中LDH的释放比例极显著降低。上述结果表明,NSP15在不同细胞中均可以抑制GSDMD-p30及GSDMD+Caspase-1两种方式引起的细胞焦亡,提示PEDV可能通过NSP15抑制细胞的焦亡。将自噬抑制剂3-MA和蛋白酶体途径抑制剂MG132分别加入不同剂量的NSP15质粒与MYC-pGSDMD质粒共转染的HEK293T细胞中,6 h后采用western blot检测细胞中GSDMD的表达水平;将上述质粒共转染HEK293T细胞,24 h后通过qPCR检测细胞中GSDMD mRNA的转录水平。结果显示,随着NSP15转染剂量的增加,细胞中GSDMD的表达水平逐渐减少,加入3-MA和MG132并不影响GSDMD的表达水平;相比于共转染空载体和NSP15质粒的对照组,MYC-pGSDMD+NSP15组细胞中GSDMD mRNA的转录水平极显著降低。上述结果表明,PEDV NSP15降解GSDMD的过程不是通过自噬和蛋白酶体途径实现的。将4个核酸内切酶活性位点突变的NSP15质粒分别与pGSDMD-p30或pGSDMD质粒共转染HEK293T细胞,24 h后采用LDH试剂盒测定各组细胞上清中LDH的释放比例;采用western blot检测各组细胞中GSDMD的表达水平。结果显示,与p30组相比,H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞上清中LDH的释放比例均无显著变化,而D^(265)突变组细胞上清中LDH的释放比例极显著降低;H^(226)、H^(241)和K^(282)突变组细胞中GSDMD的表达水平与阴性对照组细胞中GSDMD的表达水平相当,而D^(265)突变组细胞中GSDMD的表达水平明显减少。上述结果表明,PEDV通过其NSP15蛋白抑制各种细胞的细胞焦亡,且本研究首次证明该蛋白通过其核酸内切酶活性位点H^(226)、H^(241)和K^(282)降解GSDMD并抑制细胞焦亡,为PED的治疗和开发抗PED的药物提供参考。

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4以及长链非编码核糖核酸SBF2反义RNA1与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤的关系

目的探讨术前血清V-set和免疫球蛋白结构域4(VSIG4)以及长链非编码核糖核酸(LncRNA)SBF2反义RNA1(SBF2-AS1)与肾结石患者经皮肾镜取石术后急性肾损伤(AKI)的关系。方法选择2020年1月—2022年12月本院收治的109例肾结石患者为研究对象。术前检测患者血清VSIG4水平以及LncRNA SBF2-AS1表达,术后记录AKI发生情况。采用多因素Logistic回归模型分析肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的影响因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析VSIG4、LncRNA SBF2-AS1预测肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的价值。结果本研究中,术后发生AKI者16例。AKI组血清VSIG4水平低于非AKI组,LncRNA SBF2-AS1表达高于非AKI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,术前高尿酸水平、术前高LncRNA SBF2-AS1表达、较长的手术时间、术中低血压是肾结石患者经皮肾镜取石术后发生AKI的危险因素(P<0.05),术前高VSIG4水平是保护因素(P<0.05)。术前血清VSIG4、LncRNA SBF2-AS1水平预测肾结石患者经皮肾镜术后发生AKI的曲线下面积分别为0.854、0.705,二者联合预测的曲线下面积为0.948,大于各指标单独预测(Z=1.995、2.958,P<0.05)。结论肾结石患者术前血清VSIG4水平降低、LncRNA SBF2-AS1表达增高与经皮肾镜取石术后AKI的发生有关,联合检测术前VSIG4、LncRNA SBF2-AS1可预测术后AKI的发生风险。

鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定

鹅细小病毒是小鹅瘟的病原体,其基因组含有2个主要开放阅读框（ORF）,分别编码非结构蛋白（NS）和结构蛋白（VP）。为了对这2种蛋白进行抗原表位作图,设计了34个覆盖非结构蛋白NS和结构蛋白VP的50-60个氨基酸残基的重叠短肽,并进行了融合表达。用攻毒10周龄鹅血清对这34个融合蛋白进行蛋白质印迹分析,结果鉴定出NS蛋白线性抗原表位位于C末端的453-627氨基酸区域;VP蛋白线性抗原表位位于35—198、423—491、531—595、616—669和678—732氨基酸区域。

鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

利用DNAStar软件包中的Editseq将GPV H1株非结构蛋白和结构蛋白核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,分别预测结构蛋白和非结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位。结果表明,GPVH1株非结构蛋白和结构蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,其中非结构蛋白的NS2和结构蛋白的VP3含有较多的潜在的B细胞优势抗原表位。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。

水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白在疾病诊断与疫苗研发中的应用

水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的一种持续感染性疾病,危害毛皮动物养殖业的发展。水貂阿留申病毒的致病特点、免疫机制等与其他细小病毒不同,存在自身的复杂性。目前,众多研究者寻求新的疫苗来预防水貂阿留申病的发生,但没有取得理想的效果。疾病诊断及疫苗研发对防控水貂阿留申病具有积极的意义。水貂阿留申病毒结构蛋白在病毒感染、机体免疫过程中发挥关键作用,而非结构蛋白在病毒转录与复制过程中有着重要作用,疾病的诊断和疫苗的研发均在二者的基础上展开。应用水貂阿留申病毒结构蛋白与非结构蛋白建立新的水貂阿留申病毒诊断方法,研发新型基因工程疫苗,对控制水貂阿留申病的发生与传播,具有重要的意义。