肿瘤靶向基因治疗中基因转移系统的研究

目的基因定向导入靶细胞并有效表达是涉及肿瘤基因治疗安全性与有效性的关键之一.本文从基因定向转移技术及表达载体的改建、调控等几个方面对肿瘤靶向基因治疗中的基因转移系统作一综述.

靶向基因治疗恶性肿瘤的临床应用

近年来,肿瘤细胞的靶向杀伤治疗已成为肿瘤治疗的发展趋势,利用单抗、细胞因子或基因等靶向杀死肿瘤细胞是肿瘤靶向杀伤策略研究的重要进展,已成为恶性肿瘤可能治愈的手段。本文主要对急性淋巴细胞白血病、卵巢癌、肝癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌近年来的一些新的靶向基因治疗作一综述。

卵巢癌的靶向基因治疗研究进展

分子生物学和免疫学的发展为卵巢癌基因治疗研究提供了理论基础和技术方法,卵巢癌的靶向基因治疗以其准确性高、不良反应轻成为近年研究热点。载体是基因治疗的关键,载体主要包括病毒载体和非病毒载体,各有其优点及局限性。利用卵巢癌特殊启动子和潜在的候选靶向基因可提高卵巢癌基因治疗的靶向性。卵巢癌基因治疗方法包括自杀基因治疗、RNA干扰、多向耐药基因治疗、联合基因治疗等,均处于临床试验中。

卵巢癌靶向基因治疗研究进展

卵巢癌死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤之首,基因治疗是治疗卵巢癌的一种新手段。卵巢癌的靶向基因治疗能提高对肿瘤细胞的杀伤作用而不影响正常细胞,是目前研究的热点。载体是基因治疗的关键。目前应用的载体系统主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体。利用卵巢癌的特殊启动子和靶向基因可以提高基因治疗的靶向性。卵巢癌靶向基因治疗的方法主要有:分子化疗、RNA干扰、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗和联合基因治疗。卵巢癌的靶向基因治疗目前尚处于临床前实验阶段。

热疗增强mTOR靶向基因治疗体外杀伤肝癌细胞的实验研究

目的:观察热疗对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)靶向基因治疗在人肝癌细胞SMMC-7721中体外杀伤作用的影响。方法:观察不同温度热疗处理后SMMC-7721的形态学变化,并采用CCK-8试剂检测细胞增殖确定合适热疗温度,以该温度与转染pEGFP-C1-mTOR反义质粒相结合,设置联合组、转染组及对照组,CCK-8试剂检测处理后各组细胞增殖变化;流式细胞仪分析凋亡;逆转录PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印记法检测mTOR基因表达。结果:热疗后细胞皱缩、变圆,胞浆空泡化,坏死细胞比例增加。CCK-8检测示温度越高,热疗对细胞增殖抑制作用越明显,42℃热疗后抑制率达(29.7±1.7)%。联合处理后细胞增殖能力降低,流式细胞仪分析示细胞凋亡比例增加,差异有统计学意义(P<0.05)。转染后mTOR基因表达在mR-NA水平和蛋白水平均受到抑制,而联合处理后表达水平进一步下降。结论:热疗可以增强mTOR靶向基因治疗对SMMC-7721细胞的体外杀伤作用。

表皮生长因子受体介导的肿瘤靶向基因治疗的一种新策略

目的建立一种针对表皮生长因子受体(EGFR)富集的恶性肿瘤进行靶向基因治疗的方法。方法构建重组真核表达载体pcDNA3.1-PEⅢmut。将组蛋白H1亚基与表皮生长因子C环(H1-EGFc)融合蛋白作为非病毒载体,与pcDNA3.1-PEⅢmut在体外形成复合物。以此蛋白质-DNA复合物分别处理EGFR富集的BT-325和Hela细胞以及EGFR缺乏的JK细胞,并在处理48h后计算该蛋白质-DNA复合物对各细胞的杀伤率。结果含3μgDNA的H1-EGFc与pcDNA3.1-PEⅢmut复合物对EGFR富集的BT-325和Hela细胞的杀伤率分别是46.03%和48.12%,但对EGFR缺乏的JK细胞无杀伤作用。结论成功建立了针对EGFR富集恶性肿瘤的靶向基因治疗方法。

以脐带间充质干细胞为载体的靶向基因治疗系统联合5-FU对裸鼠HepG2移植瘤的作用

目的构建以人脐带间充质干细胞(HUMSCs)为载体的靶向基因治疗系统,观察该系统联合低剂量5-FU对裸鼠HepG2移植瘤的治疗作用。方法采用组织块接种法从新鲜无菌新生儿脐带中分离HUMSCs,利用PCR、重叠PCR、酶切、连接等分子生物学技术构建慢病毒表达质粒LentiR.E1A和腺病毒穿梭质粒pAd-hTERTpIL24,并包装慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。采用Transwell实验观察慢病毒和腺病毒共感染对HUMSCs向HepG2细胞趋化的影响。采用皮下接种的方法建立HepG2移植瘤模型,将荷瘤小鼠分成5组各5只,分别给予尾静脉注射PBS、HUMSCs、低剂量5-FU、慢病毒感染HUMSCs联用低剂量5-FU、双病毒共感染HUMSCs联用低剂量5-FU的治疗,比较各组的抑瘤效应。利用BD Annexin-Ⅴ-PE凋亡试剂盒检测腺病毒Ad-hTERTp-IL24与低剂量5-FU联用诱导肝癌细胞凋亡情况。结果成功构建了慢病毒表达载体p LentiR.E1A和腺病毒表达载体pAd-hTERTp-IL24,并成功包装出了慢病毒LentiR.E1A和腺病毒Ad-hTERTp-IL24。Transwell实验显示,慢病毒和腺病毒共感染HUMSCs向肿瘤细胞的迁移能力无明显改变。联合低剂量5-FU治疗裸鼠肝移植瘤中治疗组肿瘤体积较对照组减小(P<0.01)。Ad-hTERTp-IL24与低剂量5-FU联用诱导肿瘤微环境内的肿瘤细胞发生凋亡,其荧光强度明显强于Ad-Track+5-Fu组和5-Fu组。结论成功构建了以HUMSCs为载体的靶向基因治疗系统,由HUMSCS.LentiR.E1A运载携带抑瘤基因的腺病毒Ad-hTERTp-IL24联用低剂量5-FU对裸鼠HepG2移植瘤有明显抑制作用。

一种嵌合型调控元件在肿瘤靶向基因治疗中的应用

肿瘤靶向基因治疗成功的关键是调控治疗基因在肿瘤细胞中特异、高效地表达。首次构建一种嵌合型表达调控元件,旨在转录水平、转录后水平和翻译水平上实现联合调控目的基因在肿瘤细胞中特异性表达。体外实验表明,在前列腺癌细胞系LNCa P中,该调控元件可将报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和荧光素酶(luciferase)的肿瘤表达特异性分别提高420%和480%。体外细胞存活实验表明,运用该元件调控单纯疱疹病毒-1胸腺激酶(HSV-1 TK)的表达能特异性杀伤LNCa P细胞,验证了该元件可成功用于治疗基因的肿瘤靶向表达。

抗体在靶向基因治疗中的应用

基因治疗是将人的正常基因或有疾病治疗作用的基因导入人体靶细胞，从而达到治疗目的的生物医学技术。基因治疗正处于持续发展的阶段，已成为重要的医药产业。综合来说，抗体在基因治疗中主要应用于两方面：①直接将抗体基因导入体内，表达出的蛋白产物作为治疗分子发挥治疗作用[1-2]；②作为基因转移系统的靶向成分在基因治疗中发挥作用。本文将重点介绍第二方面的研究进展。

急性淋巴细胞白血病靶向基因治疗的研究进展

目的探讨急性淋巴细胞白血病靶向基因治疗的研究进展。方法 120例急性淋巴细胞白血病患者,随机分成对照组和实验组,各60例。实验组使用靶向基因治疗,对照组采取常规方法 ,对比两组的治疗效果。结果实验组显效35例,有效20例,无效5例,总有效率为91.67%;对照组显效8例,有效12例,无效40例,总有效率为33.33%。实验组总有效率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向基因治疗对于急性淋巴细胞白血病患者预防和减少并发症的发生,促进患者康复和缩短住院时间有一定积极意义。

肝癌的分子肿瘤发生学和靶向基因治疗

华中科技大学同济医学院同济医院林菊生教授报告，在完成大规模基因测序后，人类进入了后基因组学时代，越来越多的基因功能被阐明，实验和临床研究取得了令人兴奋的结果，可以成为肝细胞癌基因治疗靶点。然而肝癌基因治疗的临床成功和广泛应用仍面临挑战，如治疗基因的选择。为获得高效特异的治疗基因，他们在前期研究的基础上着重选择了3个与肝癌发生相关的新的功能基因，分别为PEG10，XIAP和HURP。研究显示这三个基因在肝癌细胞和组织中均呈过度表达，其中PEG10基因还在胃肠道肿瘤中表达。PEG10及HURP基因具有调控细胞周期促进肿瘤生长的作用，用siRNA技术下调这两个基因表达，可明显抑制肿瘤生长。表明上述3个基因参与了肝癌的发生，可成为肝癌基因治疗的侯选靶点。

HSV-tk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析

背景与目的:阻断肿瘤组织内血管生成和血管化是一个很有发展前景的灭瘤途径之一。胸苷激酶自杀基因系统(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk/GCV)能有效杀伤血管内皮细胞,目前多采用巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)作为启动子,但其杀伤缺乏特异性。KDR(kinasedomaininsertcontainingreceptor)是血管内皮生长因子的两种受体之一,它在肿瘤血管内皮细胞中高表达,而在正常组织中呈低表达。本研究是构建KDR启动子介导的HSV-tk重组腺病毒、并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法:采用pAdeasy系统,按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间,构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的AdKDR-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染人脐静脉血管内皮细胞系(humanumbilicalvenousendothelialcells,HUVEC)和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2。用更昔洛韦(ganciclovir,GCV)处理受染细胞,并以MTT法检测其细胞增殖情况。结果:经限制性酶切分析,RT-PCR及PCR方法鉴定,插入基因大小、位置、方向正确。病毒滴度为1×1010pfu/ml。在感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100的条件下,GCV浓度由0增至50μg/ml时,感染含AdKDR-tk的HUVEC细胞和HepG2细胞存活率由100%分别下降至(28.94±5.67)%和(75.45±2.91)%(P<0.01)。结论:构建的含KDR-tk重组腺病毒可在血管内皮细胞中特异性地表达HSV-tk。

VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。

大肠癌基因治疗研究进展

随着分子遗传学和分子生物学的发展及基因工程技术的进步，基因治疗已成为继手术、化疗、放疗之后的又一新的肿瘤治疗手段。本文仅就大肠癌的基因治疗的现状、进展，存在的问题和未来前景作一综述。

当前肿瘤基因治疗中存在的主要问题及其解决途径

本文概述了当前肿瘤基因治疗研究中存在的一些主要问题 ,如绝大多数治疗方案中目的基因只有一个 ,肿瘤基因治疗缺乏靶向性 ,基因转移载体的效率、安全性及容量等问题。讨论了解决这些问题的主要途径 ,即肿瘤多基因联合治疗、直接体内途径基因治疗与靶向基因治疗、基因转移载体的改造。

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应。方法通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达。结果转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降。hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低。结论hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性。

磁性纳米颗粒Fe_3O_4@PEI介导靶向自杀基因联合磁流体热疗对肝癌移植瘤的抑制作用

目的:探讨磁性纳米颗粒Fe_3O_4@PEI介导靶向自杀基因联合磁流体热疗对肝癌移植瘤的特异性杀伤作用。方法:亚克隆基因重组法构建靶向肝癌的自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK和肿瘤细胞成像报告基因载体p[HRE]AFP-Luc,并用限制性内切酶凝胶电泳法检测重组质粒是否构建成功。共沉淀法制备Fe_3O_4纳米粒并以聚乙烯亚胺(PEI)修饰后得到磁性纳米颗粒Fe_3O_4@PEI,将其作为肿瘤基因治疗的载体和磁流体热疗的介质,并利用透射电镜、粒径仪、傅里叶转换红外光谱等对Fe_3O_4@PEI进行表征鉴定。利用小动物活体成像仪检测Fe_3O_4@PEI系统运送报告基因p[HRE]AFP-Luc至荷瘤裸鼠后的生物发光信号。p[HRE]AFP-HSVTK/Fe_3O_4@PEI作用于肝癌细胞后,以MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测凋亡细胞比例,动物实验验证体内肿瘤生长速度及瘤体质量抑制效果,并用透射电镜分析肿瘤组织的亚细胞结构。结果:成功构建磁性纳米颗粒Fe_3O_4@PEI以及重组载体p[HRE]AFP-HSVTK和p[HRE]AFP-Luc,经尾静脉注射Fe_3O_4@PEI运送的p[HRE]AFP-Luc后,活体成像系统显示仅能在裸鼠肿瘤组织检测到明显的成像信号,其主要器官病理组织分析无明显病理损伤。在体外肿瘤细胞杀伤试验中,联合治疗组细胞增殖抑制率分别高于磁流体热疗组和基因治疗组([76.02±7.33)%vs (42.31±4.28)%、(47.76±4.81)%,均P<0.05],联合治疗组瘤细胞的凋亡率高于单独热疗组和基因治疗组([34.05±3.41)%vs (14.41±1.55)%、(11.64±1.20)%,均P<0.01]。体内治疗实验显示,联合治疗组移植瘤体积增长明显减慢甚至下降,瘤块质量显著小于其他单独治疗组(P<0.05);瘤块细胞亚结构出现明显的凋亡形态。结论:自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK对肝癌细胞具有选择性杀伤作用,Fe_3O_4@PEI可以作为有效的基因治疗载体和磁流体热疗的介质,其介导的肝癌靶向治疗联合磁流体热疗能特异地抑制肝癌移植瘤。