基因修复β-地中海贫血患者诱导多能干细胞可否成为治疗的希望?

背景:对于重型β-地中海贫血,目前惟一的根治方法就是造血干细胞移植,但由于合适供者来源受限及费用昂贵,大部分患者难以得到救治。体细胞重编程技术如今已日臻成熟,在患者诱导多能干细胞中进行基因修复成为了β-地中海贫血治疗的希望。目的:通过论述ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas 3种基因编辑技术体现CRISPR/Cas的优势,以及论述基因编辑技术在动物模型疾病治疗中的初步实验结果,从而展望基因编辑技术对β-地中海贫血进行基因治疗并且应用于临床的可能性。方法:以"beta thalassemia,genetic therapy,genome editing,homologous recombination,iPSCs"为英文检索词,以"β-地中海贫血,诱导多能干细胞"为中文检索词,由第一作者检索1989至2015年Pub Med数据库、中国期刊全文数据库,查阅近年β-地中海贫血的发生率和分布情况以及β-地中海贫血基因治疗的相关文献,最终保留67篇文献。结果与结论:随着基因编辑技术的发展,出现了3种定向基因编辑技术,包括ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas技术。以地中海贫血患者来源的诱导多能干细胞为靶细胞,通过ZFNs、TALENs及CRISPR/Cas9技术对疾病基因进行纠正,完成对致病基因的治疗。CRISPR/Cas系统相对于其他基因编辑技术更加简单快捷、安全高效,应用也更加广泛,利用CRISPR/Cas9系统修复β-地中海贫血患者诱导多能干细胞、生殖细胞、受精卵、胚胎中β珠蛋白基因,将为今后临床的应用奠定基础。

miRNA-142-5p在特应性皮炎中的表达及其靶基因预测

目的检测特应性皮炎(AD)患者外周血单个核细胞(PBMC)中miRNA-142-5p的表达情况,并对其进行潜在靶基因预测。方法选择2011年10月至2012年2月该院门诊皮肤科AD患者8例为观察组,与观察组年龄和性别相匹配的健康体检者6例为对照组。提取分离所有受试者PBMC中的miRNA,采用实时荧光定量PCR法,检测miRNA-142-5p的表达水平,运用miRanda、PicTar和TergetScan等靶基因预测分析软件等生物信息学方法,筛选其潜在靶基因。结果与对照组比较,miRNA-142-5p在观察组患者PBMC中的表达水平上调(P<0.05),预测到交集靶基因有39个,涉及到信号转导、细胞凋亡、细胞分化等。结论 miRNA-142-5p在AD患者PBMC中高表达,可能通过调控其下游靶基因在AD发病中起着重要作用。

广西人群DNA修复途径部分基因多态性与肝癌临床病理特征的关联研究

目的探讨广西地区人群DNA修复途径基因XRCC1、APE1、hOGG1、XPC、XPD、XPG、XRCC3多态性与肝癌临床病理特征的关系。方法收集2007年2月～2008年10月在广西医科大学第一附属医院就诊和治疗的共257例广西肝癌新发病例临床病理资料、血液DNA,应用荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantita-tive polymerase chain reaction,RT-PCR)技术对XPC499、XPC939、XPD312、XPG1104、XRCC1-194、XRCC1-280、XRCC1-399、APE1-148、hOGG1-326、XRCC3-241 10个位点进行基因分型。基因多态性与临床病理特征的关系采用2检验和非条件Logistic回归模型进行分析。结果 XRCC1-399多态与肝癌门静脉癌栓相关(P=0.036),hOOG1-326多态与包膜侵犯相关(P=0.036),XPC499多态与大体分型相关(P=0.047)。分层分析显示,在发病年龄<47岁组,XPD312基因多态与肿瘤个数有关(P=0.025)。在发病年龄≥47岁组,XPD312多态与肿瘤直径大小相关(P=0.009),XRCC1-280多态与门静脉癌栓(P=0.024)、病理分期(P=0.050)相关;不同修复途径基因多态联合作用基因型分布频率与肝癌子灶差异有统计学意义(P=0.037)。APE1-148、XPC939、XPG1104、XRCC3-241位点多态性与原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)临床病理特征差异均无统计学意义(均有P>0.05)。结论 XRCC1-280、XRCC1-399、hOGG1-326和XPC499、XPD312基因多态性可能与肝癌相关生物学行为相关。

miR-141-3p表达对人异位子宫内膜细胞增殖与凋亡影响及其机制

目的探讨微小RNA-141-3p(miR-141-3p)对人异位子宫内膜细胞(HEEC)增殖和凋亡的影响及其机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测异位子宫内膜组织及正常子宫内膜组织中miR-141-3p的表达。体外原代培养HEEC,miR-141-3p mimics转染至HEEC后,采用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。采用双荧光素酶报告实验验证miR-141-3p与高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的靶向调控作用。结果异位子宫内膜组织中miR-141-3p的表达水平明显低于正常子宫内膜组织(t=56.880,P<0.001);miR-141-3p过表达能显著降低HEEC增殖活力(t=10.972,P<0.001),升高细胞凋亡率(t=18.233,P<0.001);miR-141-3p可靶向结合HMGB1。结论miR-141-3p过表达可通过靶向调控HMGB1而抑制HEEC增殖,诱导其凋亡。

低温缺血再灌注心律失常大鼠心肌miRNA表达的变化及靶基因预测

目的明确低温缺血再灌注心律失常大鼠心肌miRNA表达的变化及其靶基因。方法清洁级健康雄性SD大鼠,2~3月龄,体重300~400 g,麻醉后开胸取心脏,建立离体心脏灌注模型。成功建立离体心脏灌注模型6个,采用随机数字表法分为2组(n=3):对照组(C组)和心脏缺血再灌注组(IR组)。采用全心停灌60 min再灌注30 min的方法制备低温心脏缺血再灌注损伤模型。记录再灌注期间心律失常评分。通过高通量测序筛选出2组心肌表达有显著性差异的miRNA(DEmiRNAs)。利用RNAhybrid和miRanda数据库对DEmiRNAs调节的mRNA行靶基因预测,通过Gene Ontology和KEGG数据库对靶基因进行富集分析,选取与心律失常密切相关且表达水平较高的miRNA进行RT-PCR检测。结果高通量测序结果:与C组比较,IR组有7个miRNA表达有显著性差异(novel-miR-17、novel-miR-19、novel-miR-30、novel-miR-43、rno-miR-122-5p、novel-miR-16和rno-miR-429)。与心律失常关系密切且表达水平较高的miRNA有4个:与C组比较,IR组心肌novel-miR-17、novel-miR-30和rno-miR-122-5p表达上调,rno-miR-429表达下调(P<0.05)。通过miRNA-mRNA相关性分析结果:GJA1基因是novel-miR-17的靶点。结论心肌novel-miR-17可能作用于GJA1基因参与大鼠低温缺血再灌注心律失常的发生。

反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制

反义寡核苷酸是一类新的基因靶向药物。随着基因组学与新一代基因测序技术的发展,以及各种新的核苷酸合成技术的出现,反义寡核苷酸药物在转化医学与精准医学中的应用取得了飞速的发展。该类药物为很多过去无法治疗的疾病提供了全新的治疗策略。本文以目前上市的几种代表性药物为例,集中阐释反义寡核苷酸药物在相关疾病治疗中的主要应用进展及作用机制,同时对该类药物开发中亟待解决的问题进行了分析。

携IgG单抗靶向超声造影剂的构建及其靶向效能的体外评价

目的构建携羊抗小鼠IgG单抗靶向超声造影剂（UCA-IgG）及体外评价其靶向黏附效能。方法采用“亲和素一生物素”桥接法构建UCAIgG，体外荧光法鉴定IgG单抗与生物素化造影剂特异结合。利用平行板流动腔在不同时间点、不同浓度小鼠IgG包被和不同剪切应力下，测定相应的UCA-IgG的结合数目及达到半数解离时的剪切应力。设不同浓度小鼠包被的平行板流动腔为实验组，羊抗小鼠IgG封闭组和空白组为对照组。结果UCAIgG发出明亮的绿色荧光，而普通脂质造影剂无荧光显示。实验组UCA-IgG结合数量随包被浓度的增高而增加（P〈0．05），并与结合时间呈明显正相关（P〈0．05），然而与剪切应力呈现双向性（P〈0．05）。而两对照组均未见明显的UCAIgG结合。UCA-IgG达半数解离的剪切应力随包被浓度的增加而增大（P〈0．05）。结论在不同血流动力学条件下UCA-IgG可与小鼠IgG特异有效结合，携羊抗小鼠IgG单抗造影剂可为其他特异靶向超声造影剂的体外研究提供有力的支持。

血友病基因治疗的研究进展

血友病的基因治疗是通过基因转导的方法，将正常的FⅧ、FⅨ基因导人患者体内，纠正遗传性基因缺陷，以持久产生可满足止血需要的正常FⅧ、FⅨ，这种治疗方法将为血友病的治疗带来新希望。血友病的基因治疗过程包括：目的基因的改造，以及载体和靶细胞的选择。血友病基因治疗的核心技术是基因转移载体技术，而基因治疗载体可分为非病毒载体和病毒载体。目前，虽然已经有多项血友病的基因治疗研究取得突破性进展，但是该治疗方法仍面临载体的应用、靶细胞的选择、针对载体和表达产物的免疫反应等许多问题，仍需要进一步研究。因此，笔者拟就血友病的基因治疗过程及其研究进展进行综述。

hsa-miR-5688在肝细胞癌中靶途径预测体系的构建与验证

目的构建并预测在原发性肝细胞癌(肝癌)中hsa-miR-5688的靶途径及调控机制,并通过TCAG数据库和串联质量标签(TMT)标记LC-MS/MS蛋白质测序方法验证其结果,以期构建准确高效的微小RNA(miRNA,miR)靶途径预测方案。方法通过五大线上数据库筛选hsa-miR-5688靶基因,对细胞定位、分子功能、信号通路、疾病、组织表达和基因互作进行富集分析,构建分析策略,预测其靶途径及调控机制。利用TCAG数据库分析调控途径中靶基因的mRNA表达量、突变频率和生存曲线;基于肝癌复发和预后良好的肝癌组织标本,应用TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS方法对靶途径中的互作蛋白进行定量检测,以验证预测体系的正确性。结果预测获得hsa-miR-5688调控的靶基因,包括信使RNA(mRNA)3031个,环状RNA(circRNA)1511个;代谢通路、细胞定位、分子功能、疾病、组织表达等富集结果经多重分析发现,靶基因RHOBTB1和UBE2W共同参与的泛素化蛋白降解途径是其调控肝癌进程的最关键信号通路。TCAG临床数据分析表明,泛素化途径的靶基因mRNA表达量在肝癌组织中明显高于正常肝组织,且基因突变会明显降低患者生存率。TMT标记蛋白质结合LC-MS/MS分析表明,与RHOBTB1和UBE2W互作的蛋白质泛素化降解相关基因UBA5、NEDD4L、UBE3C和USP14直接参与肝癌复发调控。结论hsamiR-5688可通过泛素化蛋白降解途径参与肝癌发生和复发进程,证明通过优化生物信息学构建快速预测miRNA靶途径的体系具有一定的高效性和准确性。

微小RNA-29a在肺结核患者血清中的表达及其生物学功能预测分析

目的分析微小RNA-29a（miR-29a）在肺结核患者血清中的表达，并对miR-29a的靶基因进行功能预测分析，为深入研究miR-29a与结核病感染调控机制的关系及其生物学功能奠定基础。方法病例组为未经治疗的活动性肺结核患者65例，对照组为健康志愿者45例，清晨空腹抽取静脉血，分离血清。用TRIzol试剂获取血清中总RNA，对RNA样本进一步纯化，通过紫外分光光度计和凝胶电泳检测RNA提取质量。用核酸杂交和荧光定量PCR检测miR-29a在血清中的表达。运用TargetScan与PicTar软件综合预测miR-29a的靶基因，取两者的交集作为靶基因。采用DAVID数据库对miR-29a预测的靶基因集合进行基因本体论（GO）注释描述分类，并分别提取GO的3类注释信息。采用网络调控分析软件Cytoscape中的插件BINGO进行GO注释的显著性分析。对靶基因集合进行生物通路富集分析。结果核酸杂交结果表明，病例组血清中miR-29a表达（854±93）显著高于对照组（80±22），差异有统计学意义（t=3．541，P〈0．05）。荧光定量PCR结果表明，病例组血清中miR-29a表达（1．35±0．62）显著高于对照组（0．18±0．07），差异有统计学意义（t=2．987，P〈0．05）。预测miR-29a的靶基因集合分别富集在转录调控等生物学过程、金属离子结合活性等分子功能及细胞外基质等细胞组分；miR-29a的靶基因集合显著富集于KEGG通路数据库中的黏附、细胞外基质受体相互作用等7个信号转导通路和Biocarta通路数据库中的整联蛋白信号通路、钙黏蛋白信号通路和Wnt信号通路等信号通路中。结论活动性肺结核患者血清中miR-29a表达显著上调，miR-29a的靶基因参与细胞黏附、转录调控等生物学过程。

miR-23a-27a表达载体构建及功能初探

目的构建miR-23a-27a簇真核表达载体并初步探讨该簇的靶基因及其功能。方法应用分子克隆的方法构建联合表达pre—miR-23a-27a簇及单独表达pre—miR-23a、pre—miR-27a的真核载体，应用双荧光素酶报告基因试验和real—timePCR验证该载体表达的有效性，应用microRNA靶基因预测软件和双荧光素酶报告基因试验寻找及鉴定pre—miR-23a．27a的靶基因，应用Westernblot和real．timePCR的方法在乳腺癌细胞MCF-7中初步探讨miR-27a的功能。结果（1）pre-miR-23a-27a—pcDNA3．1、pre-miR-23a-pcDNA3．1、pre—miR-27a—pcDNA3．1重组质粒能够在真核细胞HEK293T中有效转录加工出相应的miR-23a和miR-27a；（2）miR-23a和miR-27a能够同连有Sprouty2基因MRE序列的pRL—TK重组质粒作用，但是只有miR-27a能够同连有Sprouty2基因3’-非翻译区（UTR）全长序列的pRL—TK重组质粒作用，而将Sprouty2基因3’-UTR中同miR-27a结合位点定点突变后，miR-27a无法同其作用；（3）在人乳腺癌细胞MCF-7中转染pre—miR-27a—pcDNA3．1真核表达载体，能够在蛋白水平显著影响Sprouty2基因的表达，但是对其RNA水平没有显著影响。结论Sprouty2可能是miR-27a的功能靶基因，pre—miR-23a-27a—pcDNA3．1、pre—miR-23a—pcDNA3．1、pre-miR-27a-pcDNA3．1载体的构建为下-步深入研究miR-23a和miR-27a的功能奠定了基础。

分泌型卷曲相关蛋白家族在肿瘤中的研究进展

分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）可通过卷曲蛋白抑制Wnt信号通路的表达,SFRP基因启动子甲基化沉默与多种肿瘤的发生和转移相关,如结肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌等.多项研究发现SFRP具有潜在的临床价值,有望成为癌症基因诊断与治疗的新靶点.

诱导性多潜能干细胞在β地中海贫血中的应用进展

β地中海贫血是一种常见且最早被认识的单基因遗传性疾病，目前有许多治疗该疾病的方法，但这些治疗措施效果有限且成本高；而诱导性多潜能干细胞（iPSCs）是近年来迅速发展起来的干细胞技术。iPSCs技术能将体细胞重编程为干细胞，理论上可以去分化为各类细胞，再将此项技术与基因治疗技术结合起来，对彻底治愈本病有重要意义。笔者主要讨论β地中海贫血的遗传基础及相关机制、iPSCs的发现与在相关领域的应用进展，以及iPSCs用于治疗β地中海贫血中存在的问题及相关改进措施。

MiR-224在结直肠癌中的研究进展

结直肠癌是人类的第三大常见癌症,严重危害人类健康。microRNAS(miRNAs)影响结直肠癌的发生、发展,miR-224作为miRNA中重要的一员,通过作用于下游靶点,调控结直肠癌的迁移、增殖、侵袭转移和耐药,影响结直肠癌的预后。因此,本文对miR-224及靶点在结直肠癌中的作用作一综述,为结直肠癌在细胞、分子水平的诊治提供新思路。