靶序列富集多重PCR技术的发展及其应用

靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem–PCR)作为一种新型的分子生物学高通量检测技术,通过靶序列富集、靶序列加标签以及超级引物扩增3个阶段实现对靶标序列的大量扩增。靶序列富集多重PCR具有独特的反应过程,克服了常规多重PCR扩增条件不兼容、扩增具有偏爱性等缺点,实现了对同一反应体系多种病原的同步检测,为临床病原鉴别诊断、基因分型、耐药基因等领域的研究提供了新思路,具有较大的发展前景。笔者对Tem–PCR的研究背景、反应原理、技术应用及试剂盒开发等进行综述,旨在为Tem–PCR的研究和发展提供参考依据,为中国应对公共卫生危机提供新思路。

靶序列富集多重PCR-液相芯片联合检测4种常见呼吸道病毒的初步应用

目的呼吸道病毒是引起婴幼儿呼吸道感染的最主要病原体,为快速准确诊断其感染,文中建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法采集南京总医院儿科就诊的有急性呼吸道感染症状的患儿咽拭子标本120例及30例正常对照标本,分别纳入患儿组和对照组。针对A型流感病毒(Flu A)、B型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和Luminex液相芯片(x MAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了特异性、灵敏度评价。收集以急性上呼吸道感染为主要表现的患儿咽拭子标本,用上述建立的方法进行检测分析,分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及x TAG液相芯片法进行比对检测。结果建立了Flu A、Flu B、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的特异性快速分子检测方法且灵敏度可达10拷贝/μL。用快速分子检测方法和单病毒基因荧光定量PCR法对120例疑似患儿咽拭子标本进行检测,快速法阳性检出率为31.7%(38/120),荧光定量法阳性检出率为29.2%(35/120)。经一致性检验分析提示2种方法一致性较强(k>0.7)。部分标本同时采用x TAG液相芯片试剂盒进行检测,经一致性检验分析提示2种方法一致性较好(k>0.6)。结论临床的初步应用证实了4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法具备灵敏、特异、快速等优点,为临床早期、准确判断呼吸道感染的病原体提供实验依据。

反基因策略及其靶序列的选择

反基因策略及其靶序列的选择刘定燮，王昌才，黄建生（第一军医大学分子生物学研究所，广州５１０５１５）关键词三链ＤＮＡ，反基因策略合成的脱氧寡核苷酸在一定条件下可缠绕于ＤＮＡ双螺旋的大沟内并以氢键与其相互作用形成三链ＤＮＡ结构。一般把这类能形成三链结构的...

压电基因传感器检测芽孢杆菌靶序列研究

在石英晶体微天平（QCM）上用生物素-亲和素法和自组装法2种不同的方法固定寡核苷酸探针，构建压电基因传感器，对芽孢杆菌靶序列进行实时检测。结果表明：生物素一亲和索法固定探针效果更好，靶序列浓度为0．05-0．5μmol／L时，有很好的线性关系，线性回归方程为Y=93．88X＋10．88（R=0．9890，N=6，P〈0．001），非线性误差为±4．7％。该传感器特异性较好，能够识别错配3个碱基的序列。

人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体

番木瓜环斑病毒(PRSV)正引起番木瓜毁灭性严重病害,番木瓜叶扭曲花叶病毒(PLDMV)也在威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用。通过人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和HcPro基因多个保守区域的靶序列作为模板,扩增两条长短不同但大部分重叠的靶序列,并通过引物设计时添加的特定酶切位点两个靶序列反向连接,形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环,不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体pPTN-LS。该方法构建的RNAi表达载体,不仅具有快速、稳定性高等优点,还能同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列,能有效提高沉默效率,为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高,同时抗PRSV和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质的奠定基础。

黑曲霉T21 glaA 5’上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序列

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉(Aspergillus niger)T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因(glaA)5＇cis调控区特异结合的两个蛋白因子,其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点(ATG)上游-580～-509及-318～-254bp两个区域,另一蛋白因子的靶DNA定位在-809～-580区域.-580～-509序列含有“TATA”的重复结构,-318～-254序列富含“GC”以及-809～-580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A.niger T21 glaA的表达调控中可能有重要作用.

核酸靶序列的体外选择和扩增技术

核酸靶序列的体外选择和扩增技术王成济（第四军医大学生化教研室，西安７１００３２）关键词寡聚核苷酸，体外选择，ＰＣＲ基因表达的转录水平调控很大程度上依赖于基因的顺式调控元件（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓ）与反式调节因子（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ...

基于靶序列循环及DNA长距自组装的电化学传感器用于乳腺癌相关序列c-erbB2的检测

基于"核酸外切酶(ExoⅢ)辅助靶序列循环"和"DNA长距自组装"两种信号放大技术研制了一种DNA电化学生物传感器,并将其用于乳腺癌相关靶序列的高灵敏、高特异性检测。通过将发卡型探针固定在金电极表面,当靶序列存在时,在ExoⅢ的辅助下,发生杂交、酶降解、再杂交的第一重信号放大过程。接着在电极表面加入两条辅助探针,即可发生级联式杂交,形成长距超级"三明治"DNA结构。该结构可吸附大量的电活性分子六氨合钌配合物(RuHex),产生很强的电化学信号,从而实现信号的第二重放大。实验结果表明,在最佳条件下,该传感器的线性范围为10 amol/L^10 pmol/L,检出限达到8 amol/L,而且能较好地识别完全互补和错配序列,有望用于临床实际样本中超低含量靶序列的检测。

用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法的建立

文章旨在建立一种基因组目标靶序列捕捉文库的方法,并结合第二代测序技术,以实现候选基因区段的深度测序。利用Agilent公司的eArray在线平台,对1250个基因的11824个外显子共2414977bp的基因组序列进行120个碱基长度的捕捉探针(钓饵)设计,并制备成SureSelect液相靶序列捕获试剂。选用2例人基因组DNA,超声打断后末端补平并磷酸化,连接SOLiD接头,回收150bp～200bp的DNA片段,与靶序列探针杂交捕获目标序列,油包水微乳滴PCR扩增后,磁珠分离富集,上SOLiD测序系统通过工作流程分析(WFA)进行文库质量的评价,或正式测序反应。结果显示对所包含的11147个基因外显子片段设计出并合成了46509个捕捉探针,制备成SureSelect试剂盒。探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段,定量PCR显示富集效率可达29倍。WFA分析表明文库可以在SOLiD仪器进行正式测序。测序结果显示靶序列区域的测序数占有效总测序数的比例达到70%,覆盖率均在200×以上。结果表明本研究所建立的SureSelect基因组靶序列捕捉、富集建立测序文库的技术路线可行,可直接用于SOLiD测序仪的测序。

MicroRNA靶向病毒携带的microRNA模拟靶序列对病毒的抑制作用

Micro RNA模拟靶序列(target mimic,TM)通过竞争性结合miRNA,从而干扰miRNA对靶标m RNA的调控.我们前期工作发现:以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)作为载体在植物体内表达TM序列有效地抑制了miRNA的活性或稳定性,从而消减了miRNA对靶基因的调控.但是,miRNA与CMV携带的TM序列的结合在一定程度上抑制了病毒的积累.研究分析了miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒抑制作用的内在原因.a.通过RNA印迹分析CMV携带不同miRNA TM序列对病毒积累的影响,进一步明确miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒的抑制作用;b.利用GFP作为报告基因,通过荧光显微镜、蛋白质印迹以及RNA印迹分析TM序列对重组病毒积累的影响;c.以GFP作为报告基因,利用荧光显微镜观察和免疫印迹方法分析模拟靶序列对GFP翻译的影响;d.利用CMV病毒的反式复制系统分析miRNA模拟靶序列对病毒负链RNA合成的影响.结果表明,多种植物内源的miRNA靶向CMV基因组携带的miRNA TM序列,在不同程度上抑制了病毒的积累,miRNA与其TM序列的结合抑制GFP蛋白的翻译和负链的合成.植物内源的miRNA通过与病毒基因组携带的miRNA模拟靶序列结合,通过抑制病毒蛋白的翻译以及病毒负链RNA的合成,从而降低了病毒的积累水平.基于该论文的研究结果有可能建立一种抗病毒的新方法.

不同16S rDNA靶序列PCR-DGGE分析油页岩细菌多样性

为全面了解油页岩细菌群落组成结构,同时筛选出适于油页岩PCR-DGGE的最佳引物,采用改进SDS高盐提取法,提取抚顺西露天矿油页岩微生物总DNA,并用968F/1401R,338F/518R,341F/907R和1055F/1406R,对16S rDNA V6-V8,V3,V8和V9区进行PCR-DGGE分析.结果表明,4组引物均能较好扩增出目的基因,但不同靶序列对多样性检出有显著影响(P<0.001);与其他引物相比,968F/1401R和338F/518R获得的指纹图谱物种丰富度更高,检出细菌类群更丰富,较适合油页岩样品.油页岩细菌群落组成较简单,优势细菌包括不动杆菌属、假单胞菌属和埃希氏菌属,同时还有假单胞菌目和肠杆菌目尚未被鉴定的一些种类.

靶序列富集多重PCR结合DHPLC同时检测5种食源性致病菌

目的建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌5种食源性致病菌的简便、灵敏的高通量方法。方法根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计5对特异性引物,与通用引物连接构成复合引物。经过反应条件的优化,建立了5种致病菌的靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)扩增方法,扩增产物采用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术进行检测。结果采用Tem-PCR-DHPLC方法,检测48株试验菌株,未发现非特异性结果。对5种致病菌检测灵敏度,除金黄色葡萄球菌为620 cfu/mL外,其余都小于100 cfu/mL。对4种样品的检测结果与国家标准方法相符合。结论 Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决引物扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。

基于Smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究

为了探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用,采用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),用脂质体介导瞬时转染BERP35T 2肺癌细胞系,并采用Northernblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。结果表明,根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对2个不同靶序列的siRNAs;Northernblot杂交显示,在转染siRNA的BERP35T 2细胞中,不管是内源性的还是外源性的,Smad7mRNA的表达丰度均明显下降。说明Smad7基因编码区中542563bp及701722bp2个区域均是siRNA作用的有效靶序列,本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制Smad7基因的表达。

靶序列富集多重聚合酶链式反应在儿童细菌性肺炎病原体检测中的应用

目的分析靶序列富集多重聚合酶链式反应(Tem-PCR)在儿童细菌性肺炎病原体检测中的价值,为临床诊治工作提供客观研究依据。方法选取2015年6月-2016年6月212例社区获得性肺炎(CAP)患儿作为研究对象,采集所有纳入患儿的呼吸道深部吸引物,分别对其进行细菌培养和Tem-PCR检测。结果有123例患儿的呼吸道分泌物标本细菌培养检出病原菌,检出率为58.0%,共检出病原菌127株,其中,革兰阴性菌和革兰阳性菌分别占76.4%和23.6%,主要病原菌为流感嗜血菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌,分别占20.5%、14.2%、12.6%;有85例患儿的呼吸道分泌物标本Tem-PCR检测呈阳性,阳性率为40.1%,共检出105株病原菌靶基因,其中,流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌的比例最高,分别占40.0%、38.1%、10.5%;Tem-PCR检测对流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌等的诊断特异度均较高,对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的诊断敏感度和Youden指数均较高。结论 Tem-PCR检测在儿童CAP特定病原菌的早期诊断中具有一定的应用价值,可作为细菌感染性CAP病原学诊断的辅助手段。

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。

反基因技术中识别多聚嘌呤靶序列嘧啶断点的寡核苷酸

识别 CG断点的寡核苷酸包括 T* CG配对的顺向嘧啶 (TC)和 T* CG配对的反向嘌呤 (G、GA、GT) 寡核苷酸 ,其中以 T* CG配对的反向 GT寡核苷酸亲和性最高。识别 TA断点的寡核苷酸包括 G* TA配对的顺向嘧啶 (TC、TG)和 C* TA配对的反向嘌呤 (GA、GT)寡核苷酸 ,其中以 C* TA配对的反向 GA寡核苷酸亲和性最高。识别 CG和 TA断点的同时存在的寡核苷酸包括 T* CG和 G* TA配对的反向 GA和 T* CG和 T* TA配对的反向GT寡核苷酸 ,以 T* CG和 G* TA配对反向

一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价

目的以60S核糖体蛋白L44(60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价。方法将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对。同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPL44基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物。利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性。采用梯度稀释(10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度。结果选出一段基于60S RPL44的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5′-CCTGATGAAAGGTGCAATG-3′,P2:5′-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3′。该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl。结论筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列。

microRNA靶序列单核苷酸多态性与胃癌易感性关系

目的 研究炎性相关基因IL-1F5（interleukin-1 factor 5）的3’非编码区microRNA（miRNA）靶序列单核苷酸多态性（SNP）与胃癌易感性关系。方法 采用1∶1频数匹配病例-对照研究对研究对象进行基因分型，应用多因素条件logistic回归及多因素降维法（MDR）分析SNP与胃癌易感性的关系及其与环境因素的交互作用。结果 rs2472188位点GC基因型（OR=1.50，95%CI=1.13-1.99）和rs2515401位点CT基因型（OR=1.42，95%CI=1.09-1.86）是胃癌的易感基因；单体型分析显示，单体型1（CCGCA）（OR=2.08，95%CI=1.27-3.40）、单体型4（CTATA）（OR=1.98，95%CI=1.48-2.66）、单体型5（CTATC）（OR=10.13，95%CI=4.43-23.16）可增加胃癌发病风险，而单体型2（CTACA）（OR=0.18，95%CI=0.12-0.28）、单体型3（CTACC）（OR=0.37，95%CI=0.23-0.59）、单体型9（GCGTC）（OR=0.39，95%CI=0.27-0.58）可降低胃癌发病风险；具有rs2472188、rs2515401以及rs2515402组合的人群是胃癌发病风险的高危人群（OR=6.17，95%CI=4.61-8.36）。结论 rs2472188位点GC基因型、rs2515401位点CT基因型是胃癌的易感基因型，多位点联合作用对于胃癌的发生可能有协同作用。

利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列

目的:利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列,比较过表达Bcl-2和正常状态下Twist1结合靶DNA序列的变化。方法:筛选常态表达Twist1的肝癌细胞系,分别转染Bcl-2表达质粒和对照空载体,收集转染后细胞以甲醛交联DNA,收集样品进行染色质免疫共沉淀,获得与Twist1蛋白结合的DNA片段进行测序分析。结果:通过对5种肝癌细胞系进行筛选,观察到HepG2可表达Twist1,其与DNA结合序列在空载体对照组和Bcl-2过表达组具有很大的差别,结合DNA数量分别为68条和212条,其中共享序列154条。结论:Twist1在不同环境下与DNA结合位点多达212个,涉及粘附分子、细胞骨架、信号转导、代谢和转录调节等多种生物学功能。