目标序列捕获测序检出红细胞丙酮酸激酶缺乏症PKLR基因新的复合突变

目的:探讨红细胞丙酮酸激酶缺乏症(pyruvate kinase deficiency,PKD)的分子发病机制。方法:应用目标序列捕获和高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)对临床拟诊PKD患儿的PKLR基因12个外显子及其侧翼序列进行测序,采用SIFT及PolyPhen-2数据库预测突变对蛋白质功能的影响,在确定患者致病基因型后,应用Sanger测序技术对此基因型进行验证。结果:NGS结果显示,患儿PKLR基因存在罕见的双重杂合突变:第5外显子661G>A(Asp221Asn)和第10外显子1528C>T(Arg510Ter),导致该基因的第221位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺,第510位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子,使PKLR基因氨基酸链编码提前终止;Sanger测序技术进一步验证了该双重突变的存在。检索相关文献及数据库显示,这两种突变在人群中的发生率极低,蛋白质功能预测均显示为有害。结论:PKLR基因661 G>A与1528 C>T双重杂合突变是该PKD患儿的分子发病机制,PKD患者同时存在上述复合突变的报道在国内外尚属首次。

靶向捕获二代测序技术在遗传性肌病诊断中的应用

目的 探讨外显子靶向捕获二代测序技术在遗传性肌病诊断中的应用价值,分析遗传性肌病基因型-表型关联.方法 筛选与肌病相关的致病基因,设计肌病相关基因二代测序靶向捕获试剂盒Sureselect（Panel Version 1和Panel Version 2）,采用外显子靶向捕获结合二代测序技术对2013年1月至2014年6月在北京大学第一医院儿科临床诊断为遗传性肌病的134例患儿进行相关基因突变检测.2013年使用Panel Version 1对77例患儿进行了基因检测,2014年更新为Panel Version 2检测了57例患儿.对134例患儿的临床资料及基因检测结果进行分析.结果 134例患儿中男89例、女45例,就诊年龄为6个月至26岁,平均6岁1个月.74例患儿确定了致病基因突变位点,基因诊断阳性率为55.22％.包括代谢性肌病1例,先天性肌病5例,肌营养不良68例[其中先天性肌营养不良1A型（MDC1A） 22例,Ullrich先天性肌营养不良（UCMD） 11例,Bethlem肌病（BM）6例,点突变导致的杜氏肌营养不良（DMD） 12例,LMNA相关先天性肌营养不良（L-CMD）5例,埃-德二氏肌营养不良（EDMD）1例,α-抗肌萎缩相关糖蛋白病（α-DG）7例,肢带型肌营养不良（LGMD）4例].结论 临床、病理分析结合靶向捕获二代测序技术为遗传性肌病的诊断提供了新的思路,即根据临床资料、生物信息学分析等综合筛选判断,以此作为确诊的主要依据.

儿童铁粒幼红细胞贫血的临床特征及基因突变谱分析

目的对铁粒幼红细胞贫血(SA)患儿的临床特征和基因突变谱进行分析,探讨目的基因捕获二代测序技术在SA患儿分子诊断中的临床应用价值,提高对SA的早期诊断和临床干预水平。方法收集36例诊断为SA患儿的临床资料,采用目的基因捕获二代测序方法进行SA相关致病基因、与血红素合成及线粒体铁代谢有关的基因检测,分析基因型与临床表型的关系。结果36例患儿中,32例为遗传性铁粒幼红细胞贫血(CSA),4例为骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞(MDS-RS)。共53%(19/36)患儿检测到CSA相关基因突变,其中ALAS2基因突变占47%(9/19),SLC25A38基因突变占21%(4/19),线粒体片段缺失占32%(6/19)。所有MDS-RS患儿均未检测到致病/可能致病性基因突变。89%(17/19)为已知致病突变,11%(2/19)为新变异。ALAS2基因新变异c.1153A>T(p.I385F)评级为"可能致病的"及SLC25A38基因新变异c.175C>T(p.Q59X)评级为"致病的"。结论儿童CSA以ALAS2及SLC25A38基因突变为主,但线粒体基因片段缺失亦占有相当比例,对于婴儿期即出现的低增生性贫血,需考虑线粒体病的可能。

41例5α-还原酶2型缺陷症患儿临床特点及SRD5A2基因突变分析

目的探讨41例5α-还原酶2型缺陷症患儿临床表型特点及SRD5A2基因突变类型。方法收集分析患儿临床资料,包括体格检查、病史、实验室检查、B超等;并提取患儿外周血基因组DNA,采用PCR扩增产物直接测序法或靶目的基因序列捕获二代测序法检测SRD5A2基因突变类型。结果41例患儿年龄从4个月至11岁不等,汉族。所有患儿染色体核型为46,XY,SRY基因检测结果阳性。病例临床主要表现为小阴茎和尿道下裂,其中单纯表现为小阴茎的有26例,占总病例人数63%;其余15例为尿道下裂合并小阴茎,占总病例人数37%。在39例患儿中检测到双等位基因突变,2例患儿只检测到1个等位基因突变。在41例患儿中,共检测出16种基因突变类型,其中c.725A>G(p.Tyr242Cys)、c.694C>G(p.His232Asp)和c.548-9T>G这3种突变类型为未报道过的新突变。在16种突变类型中,以c.680G>A(p.Arg227Gln)为主,占所有突变类型60%(48/80)。结论5α-还原酶2型缺陷症患儿临床表现以小阴茎或尿道下裂合并小阴茎为主;c.680G>A(p.Arg227Gln)突变是中国5α-还原酶2型缺陷症患儿SRD5A2基因的热点突变类型。

一个Ⅱ型先天性红细胞生成异常性贫血家系的僦3B基因型及表型分析

目的对1个Ⅱ型先天性红细胞生成异常性贫血（congenital dyserythropojetic anemia，CDA）家系进行致病基因的突变及表型分析。方法应用目标序列捕获高通量二代测序技术对1例CDAⅡ型患者SEC23B基因的外显子及侧翼区进行测序，在确定先证者的致病基因型后，应用Sanger测序法进行验证，同时检测患者直系亲属的基因型，并用Mutation Taster与PolyPhen-2软件预测突变对蛋白功能的影响，用SWISS-MODEL软件对蛋白结构进行模拟分析。结果先证者SEC23B基因存在罕见的复合杂合错义突变C．1727T〉C（P．F576S）和C．1831C〉T（P．R611W），导致该基因的第576位氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸，第611位由精氨酸变为色氨酸。Sanger测序证实了上述双重突变。先证者之姐检出C．1727T〉C杂合突变，父亲及儿子均检出C．1831C〉T杂合突变。此外，在先证者中检出一血色病相关基因HFE的杂合突变c．211C〉T（p．R71X），导致71位的精氨酸变为终止密码子，其父亲未检出此突变。上述3种突变的蛋白功能预测均为有害，分子模拟显示其改变了SEC23B蛋白的三维构象。先证者在脾脏切除后贫血有所好转，在祛铁治疗后铁蛋白有所下降。结论SEC23B基因c．1727T〉C与c．1831C〉T复合杂合突变很可能是该cDAⅡ型家系的分子发病原因，此基因型与临床表型密切相关。

SDHB基因突变相关儿童左上纵隔嗜铬细胞瘤1例并文献复习

目的分析1例罕见的儿童左上纵隔嗜铬细胞瘤临床特征及其遗传机制。方法采集患儿及其家系的临床资料。采用靶向捕获二代测序技术对患儿进行外显子组测序,再采用Sanger测序对患儿家系进行验证。结果患儿临床诊断为左上纵隔嗜铬细胞瘤,后于全身麻醉下行纵隔肿瘤切除术。测序发现患儿携带SDHB基因杂合突变(c.136G>A,p.46R>X),患儿父母均未携带该突变。目前患儿已随访3年余,未予药物治疗,情况良好。结论对临床诊断为嗜铬细胞瘤患儿进行基因检测,有助于确诊和预后评估,更有助于对患儿家族成员的遗传咨询。

一个短指症E2型伴肥胖症家系的致病基因鉴定及遗传学分析

目的鉴定1个短指症伴肥胖症家系的致病基因,为遗传咨询和产前诊断提供依据。方法先证者为郑州大学附属儿童医院内分泌遗传代谢科收治的1例临床和X线片初诊为短指症E2型伴肥胖症患儿,应用外显子捕获结合二代测序技术对先证者致病基因筛查,采用Sanger测序方法对家系进行验证和遗传分析。结果先证者PTHLH基因第1外显子发现c.125A>C错义突变,导致谷氨酰胺变为脯氨酸(p.Gln42Pro)。该杂合突变在人类基因突变数据库未见报道,SIFT (0)和PolyPhen (0.999)程序评估其可能有害。Sanger测序结果与二代测序结果一致,证实先证者的c.125A>C杂合突变来自其母亲,其舅舅和妹妹也携带相同杂合突变,但其父亲该位点无突变。结论PTHLH基因c.125A>C错义突变可能是该家系致病突变位点。