基于颗粒酶B启动子的磁共振报告基因成像监测CAR-T细胞激活状态

目的利用颗粒酶B(granzyme B,GB)启动子控制铁蛋白(ferritin heavy chain,FTH1)报告基因表达,探讨通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)监测嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T细胞)激活状态的可行性。方法通过Ficoll密度梯度离心法以及流式分选得到细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)。将GB启动子和FTH1基因连接,连同二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside 2,GD2)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)以慢病毒为载体转入CTLs,构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1细胞,以GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T和T细胞为对照。CytoTox96@非放射性细胞毒性检测各组细胞与人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)共培养后的杀伤效果,ELISA检测共孵育因子以及GB分泌量,Western blot、普鲁士蓝染色、细胞MRI检测共培养后FTH1基因的表达。结果成功获得CTLs并构建GD2-CAR-T/pGB-FTH1、GD2-CAR-T/pCMV-FTH1、GD2-CAR-T细胞,3组细胞对肿瘤细胞杀伤效果、共孵育因子以及GB分泌量均显著高于T细胞组,GB表达水平在与SK-N-SH细胞共培养后1 d最高,3 d和7 d依次降低。GD2-CAR-T/pGB-FTH1组FTH1相对表达量以及铁含量变化趋势与GB表达一致,MRI信号呈逐渐升高趋势。GD2-CAR-T/pCMV-FTH1组FTH1相对表达量、铁含量及MRI信号在各时间点均无显著差异。GD2-CAR-T和T细胞组无明显FTH1表达及聚铁效应。结论基于GB启动子的MRI报告基因成像可实时反映CAR-T细胞的GB表达水平和肿瘤杀伤作用,为CAR-T治疗提供了一种监测细胞激活状态的可视化手段。

T-SPOT联合颗粒酶B阳性Ts淋巴细胞对成人结核病诊断的价值

目的探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)联合颗粒酶B(GrB)+CD8^(+)T淋巴细胞在诊断结核病中的价值。方法选取南昌大学第一附属医院2021年2月至2022年3月疑似结核病患者212例,所有患者均保留T-SPOT结果,流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群及其穿孔素和GrB的表达,根据出院最终诊断分为结核病组和非结核病组,比较两组间T-SPOT斑点数和淋巴细胞亚群及其穿孔素和GrB表达差异,ROC曲线分析ESAT-6斑点数,CFP-10斑点数,结核特异性抗原(TBAg)与植物血凝素(PHA)斑点数的比值(TBAg/PHA)(ESAT-6/PHA和CFP-10/PHA中较大的一个),GrB^(+)Ts(CD8^(+)T)及“结核比值”[TBAg/(PHA*GrB^(+)Ts)]的诊断效能。结果GrB^(+)Ts细胞百分比在结核组中显著高于非结核组(44.95±2.98 vs 33.49±1.87,P<0.05),而总T细胞、穿孔素+T细胞,GrB^(+)T细胞,Ts细胞和穿孔素+Ts细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05);非结核组T-SPOT.TB阳性率为51.85%,明显低于结核组的92%,且结核组的A抗原斑点数及B抗原斑点数显著大于非结核组(P<0.05),ROC曲线显示A抗原诊断结核病的灵敏度和特异性分别为80.0%和56.8%,曲线下面积(AUC)为0.748,约登指数为0.368;B抗原的灵敏度和特异性为分别62.0%和77.8%,AUC为0.758,约登指数为0.398;A抗原+B抗原灵敏度和特异性为72.0%和74.1%,AUC为0.796,约登指数为0.461;结核组的TBAg/PHA比率要显著高于非结核组(1.21±0.17 vs 0.26±0.02,P<0.001)以0.59为cut-off值时,诊断结核病的灵敏度和特异性分别为66%和91.4%,AUC高达0.852,约登指数为0.574;结核组的“结核比值”要显著高于非结核组(4.58±0.87 vs 1.71±0.24,P<0.01),以1.24为cut-off值时,诊断结核病的灵敏度和特异性分别为82.0%和72.2%,AUC为0.794,约登指数为0.542。结论应用TBAg/PHA比率和TBAg/(PHA*GrB^(+)Ts)比值诊断结核病的效能要优于常规的T-SPOT检测,两者结合使用对结核病诊断可能具有重要价值。

颗粒酶B在自身免疫性疾病中的作用概述

自身免疫性疾病(AID)是一类由自身免疫失衡引起的,累及多系统的慢性炎症性疾病。人群广泛发病,病因未明,且对患者本身和全民健康水平有较大影响。颗粒酶B是一类丝氨酸蛋白酶,可以广泛切割细胞内外的各种底物,可能是影响AID发生发展的重要因素。目前颗粒酶B在AID中的作用仍然有待探究,本文概述了颗粒酶B的基因结构、表达调控、进入靶细胞的机制以及在细胞内和细胞外的功能,总结了颗粒酶B在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、血管炎和特发性炎性肌病等多种AID中的作用。旨在对AID的病因学研究进行总结,为进一步深入展开诊断、防治和预后的研究提供思路。

靶向颗粒酶B分子影像探针的研究进展

颗粒酶B作为一种免疫细胞肿瘤杀伤活性相关的生物分子,可以为恶性肿瘤免疫治疗疗效评估提供重要信息。目前相关分子探针都是基于颗粒酶B的特异性识别序列设计,按照不同的成像原理,可将其分为化学发光探针、荧光探针、正电子发射断层扫描探针。三种探针均具有良好的颗粒酶B靶向能力和实时成像的特点。但是各类探针也存在体内不稳定、易受体内其他环境影响等不足,未来仍需要进一步探究改进。该文对靶向颗粒酶B分子探针的特点和应用进行总结,以期为后续研究提供理论参考。

恶性肿瘤患者外周血穿孔素颗粒酶B的表达与患者的免疫相关不良事件发生的相关性分析

分析使用免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗的恶性肿瘤患者外周血总T(CD3+)淋巴细胞、细胞毒性T(CD8+、CTL)淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞中穿孔素、颗粒酶B的表达,探讨其与免疫相关不良事件(irAE)的相关性。方法 应用流式细胞术检测244例恶性肿瘤患者用药后样本中CD3+T细胞、CD8+T细胞及NK细胞中穿孔素、颗粒酶B的表达;选取2022年12月-2024年3月244例接受免疫治疗的晚期恶性肿瘤患者,根据患者是否出现irAE分为irAE组(n=140)和非irAE组(n=104),分析对比两组患者的基线临床资料、irAE发生情况。结果 两组患者的基线临床资料经对比差异均无统计学意义(P>0.05);244例患者中140例(57.38%)发生了irAE,其中发生率最高的为皮肤反应41例(29.29%),其次为免疫性肝炎19.29例(17.14%)、疲乏23例(16.43%)、内分泌毒性21例(15.00%)、免疫性肺炎16例(11.43%)、胃肠道反应12例(8.57%)等irAE,irAE发生多为1-2级,3-4级多为免疫性肺炎。irAE组外周血T淋巴细胞亚群中穿孔素和颗粒酶B表达均高于非对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),irAE组和非irAE组NK细胞中穿孔素和颗粒酶B差异无统计学意义(P>0.05)。ROC曲线分析结果显示,irAE组CD3+T细胞、CD8+T细胞中颗粒酶B和穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3+T细胞、CD8+T细胞中颗粒酶B和穿孔素表达与irAE发生呈正相关(P<0.05)。结论 外周血CD3+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞中颗粒酶B及穿孔素的表达与使用ICIs治疗的恶性肿瘤患者发生irAE有关,可辅助临床上irAE的早期筛查、诊断。

穿孔素与颗粒酶B在乙型肝炎不同免疫状态中的作用

穿孔素(perforin,PFN)是存在于细胞毒性细胞[又称杀伤细胞,包括自然杀伤(natural killer,NK)细胞、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,CTL)等]的糖蛋白,颗粒酶(granzyme,Gzm)B是表达于杀伤细胞的小分子蛋白质。PFN和Gzm B贮存在细胞毒性细胞的胞浆颗粒中,在与靶细胞接触后通过胞吐而释放。作为细胞毒性细胞所具有的2类重要效应分子,PFN和Gzm B在各种类型肝损伤免疫反应中发挥重要作用。在造成肝损伤的众多原因中,对乙型肝炎所致肝损伤研究较多。HBV复制与宿主抗病毒免疫的相互作用决定了HBV感染的最终结果,PFN和Gzm B是病毒感染的病原清除和靶细胞凋亡重要的介导物质,在HBV感染的不同阶段,PFN和Gzm B表达水平呈现不同特点:在急性HBV感染期,CTL高表达PFN、Gzm B;在慢性HBV感染期,NK细胞、CTL表达PFN、Gzm B呈下调趋势;在重症乙型肝炎阶段,CTL表达PFN、Gzm B的上调可能参与HBV感染重症化。本文主要对HBV感染免疫阶段PFN和Gzm B在不同免疫状态中具体作用特点作一介绍。

靶向颗粒酶B分子影像探针的作用机制及应用研究进展

颗粒酶B作为一种免疫相关生物标志物,其表达水平与细胞毒性T细胞密切相关,可为恶性肿瘤免疫治疗疗效评估提供重要信息。靶向性分子影像探针能够准确检测免疫治疗前后体内颗粒酶B的表达水平。目前相关分子探针都是基于能够被颗粒酶B特异识别的多肽序列设计的,主要分为近红外荧光(NIRF)探针和正电子发射断层扫描(PET)探针两类。NIRF探针包括可激活类探针(如CyGbPF、CyGbPP、GNR)、自组装类探针(如G-SNAT-Cy5、Cy5.5-CBT-NPs);PET探针包括酶结合类探针(如68Ga-NOTA-GZP、[18F]AlF-mNOTA-GZP、68Ga-grazytracer)及酶剪切类探针(如64Cu-GRIP B)。两类分子影像探针均有很好的靶向颗粒酶B的能力,可预测免疫治疗的效果。但这些分子探针也存在靶部位摄取低、体内不稳定、易受体内其他环境干扰等不足,未来仍需深入研究并进行更多的临床试验,才能将此类探针应用于多种肿瘤的免疫治疗疗效评估。

颗粒酶B在肿瘤诊治中的研究进展

肿瘤免疫治疗在肿瘤治疗中的地位日益提高。肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应,从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。颗粒酶B主要由细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌,参与细胞凋亡的过程,是免疫细胞发挥抗肿瘤作用的重要因子。本文重点阐述了颗粒酶B的基本生物学功能及其在肺癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤治疗中的研究进展。

乳腺癌患者外周血中颗粒酶B和穿孔素的表达及意义

目的分析乳腺癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达对乳腺癌的诊断价值,明确颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌分子分型、肿瘤分期等临床病理特征的相关性及其对乳腺癌治疗效果的评价。方法应用流式细胞术检测108例乳腺癌和70例乳腺良性疾病患者样本中CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达;采用受试者工作特征(ROC)曲线评估各指标对乳腺癌的诊断效能,比较不同临床病理特征乳腺癌患者颗粒酶B和穿孔素的表达及治疗前后各指标的变化。结果乳腺癌患者T淋巴细胞亚群与NK细胞中颗粒酶B和穿孔素表达均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞及NK细胞中颗粒酶B和穿孔素阳性率的曲线下面积(AUC)大于0.5。CD3^(+)T细胞中颗粒酶B和穿孔素的表达与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P<0.05),CD8^(+)T细胞中颗粒酶B也与乳腺癌肿瘤大小及临床分期呈正相关(P<0.05)。乳腺癌患者淋巴结转移组中CD3^(+)T细胞中颗粒酶B和穿孔素表达明显高于无淋巴结转移组(P<0.05)。乳腺癌患者治疗后外周血T淋巴细胞中颗粒酶B和穿孔素表达高于治疗前(P<0.05)。结论外周血CD3^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞和NK细胞中颗粒酶B及穿孔素的表达对于诊断乳腺癌有一定的参考价值,且与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期有关,可辅助临床上乳腺癌的早期筛查、诊断及治疗效果评价。

穿孔素与颗粒酶B在鼻NK/T细胞淋巴瘤诊断中的意义

目的 检测鼻NK/T细胞淋巴瘤中的穿孔素、颗粒酶B表达分布情况 ,为临床治疗和预后判断提供依据。方法 运用免疫组化S P法检测 11例鼻NK/T细胞淋巴瘤中穿孔素、颗粒酶B的表达和分布情况 ;同时与组织芯片中其他类型淋巴瘤进行比较研究 ,10例淋巴组织反应性增生作为对照。结果 11例鼻NK/T细胞淋巴瘤中均见穿孔素和颗粒酶B过度表达。以 6 0例淋巴瘤制成组织芯片的 4 2例B细胞淋巴瘤中见 11例少许穿孔素和 14例少许颗粒酶B阳性表达细胞散在分布于瘤细胞间 ,10例外周T细胞淋巴瘤中 8例少许表达穿孔素和 9例少许表达颗粒酶B。 2例间变性大细胞淋巴瘤见少许穿孔素和颗粒酶B阳性表达细胞。 2例霍奇金淋巴瘤阴性。NK/T细胞淋巴瘤的穿孔素和颗粒酶B表达程度与T、B淋巴瘤比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。结论 穿孔素和颗粒酶B是鉴定活化的细胞毒性细胞的免疫标记物 ,可作为NK/T细胞淋巴瘤的诊断性标记物 ;其在外周T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤中的表达 ,反映了机体存在抗肿瘤的免疫反应机制。

EV71手足口病患儿CD8^+T、NK细胞穿孔素和颗粒酶B的变化

目的探讨肠道病毒7l型(EV71)手足口病患儿CD8^+T、NK细胞穿孔素(PRF)和颗粒酶B(Grz B)的变化。方法选取某儿童医院2017年5—7月普通型、重型手足口病患儿(普通型组、重型组),健康儿童志愿者(正常对照组)各30例,采用流式细胞术测定外周血CD8^+T、NK细胞PRF和Grz B的表达水平,比较各组差异。结果与正常对照组相比,普通型组和重型组EV71手足口病患儿急性期两种细胞中PRF和Grz B的表达水平均升高,差异有统计学意义(均P <0. 05)。普通型组和重型组EV71手足口病恢复期患儿CD8^+T细胞PRF、Grz B的表达水平较急性期明显下降,但仍高于正常对照组(均P <0. 05)。NK细胞PRF、Grz B的表达水平:普通型组和重型组急性期比较,差异均无统计学意义(均P> 0. 05);普通型组EV71手足口病恢复期患儿较急性期虽稍升高,但差异仍无统计学意义(均P> 0. 05);重型组EV71手足口病恢复期患儿较急性期明显升高(均P <0. 05)。结论 CD8^+T、NK细胞PRF和Crz B在EV71手足口病发病中起着一定作用。

Fas/FasL和颗粒酶B在口腔扁平苔藓中的表达及意义

目的探讨Fas/FasL、颗粒酶B与口腔扁平苔藓(orallichenplanus,OLP)中的细胞凋亡及与OLP病变发生发展的关系。方法采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL法)、免疫组化技术检测50例(20例糜烂萎缩型,30例非糜烂型)OLP及10例正常口腔黏膜中Fas、FasL及颗粒酶B的表达及细胞凋亡情况。结果OLP上皮细胞的凋亡指数(95.32±28.99)比正常对照组(42.52±0.05)高(P<0.05),且OLP中凋亡上皮细胞多位于基底层或基底上层,而正常对照组的凋亡上皮细胞多位于表层及棘层。OLP固有层淋巴细胞的凋亡指数(35.12±9.89)则低于正常组(61.58±0.10)(P<0.05)。OLP固有层FasL及颗粒酶B的阳性率分别为68%、68%,均高于正常对照组(P<0.05),其中糜烂萎缩型OLP固有层中淋巴细胞FasL及颗粒酶B的表达均明显高于非糜烂型OLP(P<0.05)。结论口腔扁平苔藓中同时存在角质细胞的凋亡增加及淋巴细胞凋亡的减少,Fas/FasL及颗粒酶B可能与这种凋亡的异常相关,且FasL及颗粒酶B的高表达与OLP病情发展有密切关系。

颗粒酶B和可溶性Fas配体在病毒性心肌炎血清中的表达与心脏超声心功能的关系

目的探讨病毒性心肌炎(VM)患儿急性期血清颗粒酶B(GrB)和可溶性FasL(sFasL)水平变化及其与心脏超声和心脏收缩功能的关系。方法采用ELISA方法检测60例VM和40例健康儿童血清GrB和sFasL水平,同时对VM患儿行心脏超声及心功能检查。测定心脏指数(CI)、射血分数(EF)、心轴缩短率(SF)、每搏指数(SI)、左室内径(LV)、左房内径(LA)、右室内径(RV)。结果VM组GrB和sFasL水平显著高于对照组(P均<0.01);VM患儿血清GrB与sFasL水平呈正相关(r=0.7608 P<0.05);VM组GrB和sFasL升高者,心脏超声检查示心脏扩大、心肌动度减弱和心功能下降发生率明显增加(P均<0.05)。结论血清GrB和sFasL可作为判断VM患儿心肌损害程度及评估心功能的辅助指标。

原发性免疫性血小板减少症患者颗粒溶素、颗粒酶B、穿孔素的表达及临床意义

目的研究颗粒溶素（granulysin，GNLY）、颗粒酶B（granzymeB，GrB）及穿孔素（perforin，PFP）三种免疫分子在原发性免疫性血小板减少症（primaryimmunethromboeytopenia，ITP）患者外周血单个核细胞（peripheralbloodmononucle—arcells，PBMC）中的表达及其临床意义。方法使用实时荧光定量PCR（RFQ_PCR）和免疫印迹法（westernblot，WB）检测30例ITP患者和40例健康人PBMC中GNLY，GrB及PFP的mRNA和蛋白含量。分析ITP患者三种蛋白含量与IL-2，IL-4，IL-10和IFN-γ的相关性。结果与健康对照组比较，ITP患者PBMC中GrB，PFPmRNA（1．78±0．13VS1.0O±0．03；1．96±0．11VS1．O0±0．04）及蛋白含量（2．05±0．19VS1．02±0．10；2．03±0．23VS0．92±0．15）均升高（t=23．016～45．594，P值均〈0．01），而GNLY变化差异无统计学意义（P〉0．05）。ITP患者中GrB，PFP蛋白表达水平与血小板数量呈负相关（r=-0．401，-0．486，P〈0．05），与IL-2（r=0．515，0．565），IFN-γ（r=0．478，0．544）水平呈正相关（P〈0．05），与IL-4，IL-10无相关性（P〉0．05）。结论GrB及PFP可能参与ITP的发病机制，为探讨ITP的病因和治疗提供了新线索。

隐球菌性脑炎患者颗粒酶B、颗粒溶素、穿孔素的表达及临床意义

目的研究颗粒酶B(granzymeB,GrB)、颗粒溶素(granulysin,GNLY)及穿孔素(perforin,又称pore-forming pro-tein,PFP)三种免疫效应分子在隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)外周血单个核细胞中的表达及其临床意义。方法首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),其次用免疫印迹(westernblot)的方法检测其中的GrB、GNLY、及PFP的蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中GrB、GNLY、及PFP的mRNA含量。并分析隐球菌性脑膜炎患者蛋白含量与一些免疫指标的相关性。结果与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中GNLY、PFP蛋白含量和mRNA均明显降低,而GrB无明显变化。隐球菌性脑膜炎患者中GNLY蛋白表达水平与血清IgG、IFN-γ水平成正相关(r=0.477,P<0.05;r=0.534,P<0.05),与IL-10水平成负相关(r=-0.505,P<0.05)。结论GNLY、PFP可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索。

血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶B靶向性抗肿瘤血管生成

目的 观察血管内皮生长因子受体 (VEGFR)结合肽 -颗粒酶 B(Gra B)融合蛋白抗血管生成的作用 .方法 抽提人外周血淋巴细胞总 RNA,进行 RT- PCR克隆 Gra B c DNA;抽提 L o Vo细胞总 RNA,进行 RT- PCR克隆 VEGFR结合肽c DNA,用限制性酶切和 DNA测序进行鉴定 ;通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)分析表达产物 .表达产物经亲和层析纯化后 ,以人血管内皮细胞 (ECV30 4 )和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性 .结果 表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中 ,具有良好的抗原性和特异性 ,且具有抑制血管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性 .结论 VEG-FR结合肽 - Gra B融合蛋白具有抑制血管生成的功能 。

颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA——颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径

目的 :颗粒酶B(GranzymeB ,GraB)对核内物质具亲和力 ,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GraB聚积 ,观察GraB是否直接作用于基因组DNA。方法 :通过抽提人外周血淋巴细胞总RNA ,进行RT PCR克隆GraBcDNA ,构建GraB原核表达载体 ,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定 ;异丙基 1 硫代 β 呋喃半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析表达产物。表达产物经亲和层析纯化后 ,观察其对基因组DNA的功能。结果 :表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中 ,具有良好的抗原性和特异性 ,特异性底物检测有活性 ,且具有直接作用于部分断裂的基因组DNA ,使其发生进一步裂解的活性。结论 :GraB直接作用于部分断裂的基因组DNA ,这可能是GraB诱导细胞凋亡新的作用途径。

实时荧光定量PCR检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因的表达

目的:建立可用于测定淋巴细胞免疫功能的SYBRGreen I实时荧光定量PCR技术。方法:根据NCBI基因库中4种基因(NKG2D、穿孔素、颗粒酶B和内参照GAPDH)的序列,设计合成相应的引物,扩增上述基因。建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法,检测肿瘤患者外周血淋巴细胞和诱导培养的患者CIK细胞(cytokine induced killer,CIK)中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B mRNA的含量。结果:应用设计的引物扩增NKG2D、穿孔素和颗粒酶B基因后,经琼脂糖凝胶电泳和溶解曲线分析表明具有特异性。SYBR Green I实时荧光定量PCR检测结果表明,肿瘤患者的淋巴细胞中颗粒酶B基因的表达降低,而经细胞因子和单克隆抗体诱导培养的肿瘤患者CIK细胞与其淋巴细胞相比,细胞中穿孔素和颗粒酶B基因的表达明显增加(P<0.01)。结论:该SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法可用于检测淋巴细胞中NKG2D、穿孔素和颗粒酶B的mRNA的表达、作为研究淋巴细胞免疫功能的有力手段。

肾移植急性排斥反应患者血清IL-15、穿孔素及颗粒酶B mRNA的表达

目的探讨白细胞介素15（IL-15）、穿孔素（PFP）、颗粒酶B（GraB）mRNA在肾移植急性排斥反应（AR）、环孢素A（CsA）肾毒性、细菌感染时的变化。方法采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-PCR）方法动态检测45例肾移植患者外周血淋巴细胞（PBL）中IL，15、PFP及GraB mRNA表达的变化。结果AR组IL-15、PFP及GraB mRNA的表达均高于肾功能稳定组，较临床症状出现早2～3d；经激素冲击治疗后，PFP及GraB mRNA的表达减弱，但IL-15 mRNA未见明显减弱。细菌感染组PFP和GraB mRNA的表达水平亦上升，但IL-15 mRNA的表达水平未见明显升高。CsA中毒组三项指标在监测过程中均未见明显变化。结论FQ-PCR测定PBL中IL-15、PFP及GraB mRNA表达是一种无创、较敏感的早期检测AR的方法，并可以预测抗排斥反应的治疗效果。IL-15作为CD8记忆T细胞生长和活化必须的细胞因子，可能是介导AR发生的重要因子。它受细菌感染因素干扰少，与PFP和GraB mRNA同时检测对AR的判断更为准确。

截短型转位肽重组抗体/颗粒酶B基因的构建及表达

目的 :构建携带截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体 ,并将其在HER2阳性SKBR 3肿瘤细胞及HER2阴性Hela肿瘤细胞中表达。方法 :用PCR法获得截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因片段 ,并克隆构建真核表达载体 ,以脂质体法转染SKBR 3细胞及Hela细胞 ,用免疫细胞化学染色检测其在不同细胞中的表达及对细胞形态的影响。结果 :成功构建了编码截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因的真核表达载体pCMV e2 3sFv FSD GrB ,用免疫细胞化学检测发现 ,绝大多数Hela细胞可高表达e2 3sFv FSD GrB蛋白 ,且细胞形态正常 ,而表达e2 3sFv FSD GrB蛋白的SKBR 3细胞形态发生变化 ,出现固缩细胞。结论 :截短型转位肽重组抗体 /颗粒酶B基因真核表达体系的建立 ,为确定PE转位肽的最小转位功能区段奠定了基础。