抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价。结果获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7。腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上。结论获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件。

骨唾液酸蛋白对Caspase介导的RAW264.7细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨骨唾液酸蛋白(BSP)对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)介导破骨细胞前体RAW264.7凋亡中所起的作用。方法:培养破骨细胞前体RAW264.7,加信号通路相应抑制剂和(或)BSP处理后,用Caspase3/7/8/9检测试剂盒检测细胞Caspase3/7/8/9的活性,用Co-IP检测Caspase-8与整和素ανβ3是否存在相互作用。结果:BSP处理后RAW264.7细胞的Caspase-3/8/9活性下降,显著抑制了RAW264.7细胞的凋亡;而Caspase-8活性与Caspase-3活性存在正相关关系;且Caspase-8与整合素αvβ3存在相互作用。结论:BSP对RAW264.7细胞的抗凋亡作用主要通过调节外源性细胞凋亡途径来实现,并且由Caspase-8引起的细胞凋亡可因BSP与αvβ3的相互结合而抑制。

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA

骨唾液酸蛋白(BSP)的结构与功能

骨唾液酸蛋白 (Bonesialoprotein ,简称BSP)是细胞外基质中的一种糖蛋白 ,主要分布在矿化组织中 ,参与骨代谢 ,但近年研究发现BSP在癌细胞的骨转移中发挥作用并对血管生成有促进作用。本文对BSP的结构与功能及研究状况作一介绍。

重组人骨唾液酸蛋白的纯化及生物学活性研究

目的对毕赤酵母表达的重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行纯化和活性研究,为进一步研究BSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPICZαA-hbsp工程菌能高效分泌表达rhB-SP,采用Ni-NTA介质以亲和色谱法纯化rhBSP。通过羟基磷灰石(HA)晶体生长抑制实验、细胞黏附实验和鸡胚尿囊绒膜实验分析rhBSP的生物学活性。结果纯化的rhBSP达到电泳纯,并能抑制HA晶体生长,可介导乳腺癌细胞黏附和促进血管生成。结论纯化的rhBSP具有良好的生物学活性,可用于进一步研究BSP相关的病理、生理机制。

骨唾液酸蛋白对破骨细胞前体RAW264．7增殖、分化作用的信号通路

目的:探讨骨唾液酸蛋白(BSP)促进破骨细胞前体RAW264.7增殖和分化的关键信号通路与分子。方法:培养RAW264.7细胞,加BSP及信号通路相应抑制剂处理后,用MTS检测细胞的增殖,用TRAP染色试剂盒检测细胞的分化,用Calcineurin、AKT、JNK、ERK和p38活性检测试剂盒检测其活性。结果:抑制ERK和p38分子可显著抑制BSP促细胞增殖作用;抑制AKT、PI3K、Calcineurin分子可显著降低BSP的促分化作用;随着BSP处理时间的增加,RAW264.7细胞内Calcineurin活性增加;AKT活性在BSP作用48 h时最大,JNK、p38和ERK活性则在BSP作用24 h时最大。结论:BSP主要通过调节细胞内MAPK通路中的ERK和p38促进RAW264.7细胞的增殖,通过调节AKT、PI3K、Calcineurin通路促进RAW264.7细胞的分化。

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因 ,与分泌型表达载体 pPICZαA重组 ,重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株 ,获得的GS115 /pPICZαA_hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP .SDS_PAGE和Westernblot分析结果表明 ,产物的分子质量接近 6 6ku ,能发生特异性抗原

骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙人工骨的研制及释放实验

目的:研制骨唾液酸蛋白-β-磷酸三钙(BSP-β-TCP)人工骨并观察BSP-β-TCP中骨唾液酸蛋白的释放规律。方法:实验于2006-12/2007-07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。①BSP-β-TCP人工骨制备:采用低温负压冻干的方法将骨唾液酸蛋白复合于β-磷酸三钙中,按骨唾液酸蛋白含量不同制备两种样品:A样品含骨唾液酸蛋白1﹪,B样品含骨唾液酸蛋白2﹪。②观察指标:两种样品分别在恒温空气浴振荡器内(37±1)℃持续振荡。试验开始2周内每24h,以后每72h时分别吸出浸泡液100μL/次,共观察4周。用考马斯亮蓝法测定各个时间点溶液中蛋白质含量;绘制出蛋白质释放量和时间关系的散点图,再将散点图的曲线直线化,分析BSP-β-TCP人工骨中骨唾液酸蛋白的释放动力学。结果:①骨唾液酸蛋白释放率:72h内有一个爆发性的释放,释放率A样品为25.44﹪,B样品为35.11﹪;10d内的释放速度较快,A样品为39.76﹪,B样品为44.13﹪;持续4周仍有缓慢释放,A样品为55.43﹪,B样品为56.82﹪。②骨唾液酸蛋白的释放动力学:将散点图曲线进行拟和后可见释放量与时间(h)平方根成线性关系,两者的关系符合Higuchi方程。结论:骨唾液酸蛋白以扩散方式释放,β-磷酸三钙可作为良好的载体与BSP共同形成缓释系统。

ATMFS对犬骨盆弓状线骨折愈合及骨钙蛋白和骨唾液酸蛋白表达的影响

目的探索骨盆髋臼三维记忆内固定系统(acetabular tridimensional memory fixation system,ATMFS)对犬弓状线骨折愈合及骨钙蛋白和骨唾液酸蛋白表达的影响。方法选用15只成年杂种家犬,双侧髋臼臼顶上方1.5cm处横形截骨,分别采用ATMFS前柱固定器和6孔重建钢板内固定,于术后2、4、6、8、12周行影像学检查、大体观察、骨钙蛋白及骨唾液酸蛋白原位杂交、骨钙蛋白实时定量PCR(RT-PCR)检测,评价骨盆弓状线的骨愈合特征及骨钙蛋白和骨唾液酸蛋白的表达特征。结果 ATMFS侧骨折端无凌乱骨痂,骨折愈合时间明显快于钢板侧。双侧骨折端组织中骨钙蛋白和骨唾液酸蛋白表达与正常比均明显增强。术后4～8周,ATMFS侧骨钙蛋白和骨唾液酸蛋白表达量明显大于钢板侧,两侧比较具有显著性差异(P<0.05),其中术后6周双侧差异最为显著(P<0.01)。结论 ATMFS固定后于骨折端产生的持续顺应生理力线的压应力能够刺激骨钙蛋白及骨唾液酸蛋白的表达,从而促进骨折早期愈合。

骨唾液酸蛋白对乳腺癌MDA-MB-231细胞PI3K-AKT信号通路的影响

目的:探讨骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)对乳腺癌MDA-MB-231细胞PI3K-AKT信号通路的影响。方法:BSP基因沉默的乳腺癌MDA-MB-231细胞(简称231BO-BSP27)经重组人BSP(recombinant human BSP,rhBSP)和PI3K-AKT抑制剂LY294002处理后,Western blotting检测磷酸化AKT水平的变化,实时定量PCR检测caspase-3、cyclin D1 mRNA表达水平,MTT法检测细胞增殖能力。结果:与BSP基因未沉默的对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默的231BO-BSP27细胞BSP蛋白表达明显下调(74.32±2.18)%(P<0.01);AKT磷酸化水平明显下降(33.30±2.61)%(P<0.01),而caspase-3和cyclin D1 mRNA表达分别上升和下降(1.000±0.000 vs 1.733±0.039,1.000±0.000 vs 0.370±0.012;均P<0.01);231BO-BSP27细胞增殖能力显著下降(P<0.05)。外源添加rhBSP蛋白分别上调231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞AKT磷酸化水平(17.86±2.27)%和(33.78±1.51)%(均P<0.01),231BO-BSP27细胞caspase-3 mRNA表达降低(1.000±0.039 vs 0.541±0.091,P<0.01)、cyclin D1 mRNA表达升高(1.000±0.000 vs 2.921±0.032,P<0.01),促进231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞的增殖(均P<0.01)。LY294002则能逆转rhBSP对231BO-Scrambled和231BO-BSP27细胞AKT磷酸化激活作用(P<0.05),使231BO-BSP27细胞caspase-3 mRNA表达升高(P<0.01)、cyclin D1 mRNA表达降低(P<0.01),使该两种细胞增殖能力下降(均P<0.01)。结论:BSP通过PI3K-AKT信号通路调控乳腺癌MDA-MB-231细胞caspase-3和cyclin D1的表达,并影响细胞的增殖。

骨唾液酸蛋白表达和女性乳腺癌骨转移的关系

目的探讨骨唾液酸蛋白(BSP)在乳腺癌组织中表达和乳腺癌骨转移的关系。方法回顾性分析840例女性乳腺癌术后患者,根据治疗后随访是否有骨转移分为乳腺癌骨转移组和无骨转移组,用免疫组织化染色法测定840例原发性乳腺癌石蜡标本中BSP的表达,采用χ2检验和COX生存分析乳腺癌治疗后骨转移和生存的影响因素。结果 840例病例单因素分析显示:年龄、原发病灶大小、TNM临床分期、分子分型表达情况与乳腺癌术后骨转移的发生差异有统计学意义(P<0.05);BSP在骨转移组表达明显高于无骨转移组(无转移组+骨外转移组)(P<0.05);乳腺癌术后骨转移与淋巴是否转移、Cerb B-2情况、是否绝经、病理类型、细胞分级无关。多因素分析显示年龄越小、肿瘤体积越大、临床分期越晚、三阴性乳腺癌、BPS高表达是乳腺癌术后骨转移的危险因素。COX生存分析提示:乳腺癌组织标本中BSP高表达和低表达术后5年生存率差异有统计学意义(P<0.05)。结论初诊时临床分期、年龄、原发病灶大小、分子分型是乳腺癌术后发生骨转移的主要危险因素,BSP表达可能和乳腺癌术后骨转移及疾病进展相关。

骨唾液酸蛋白的表达对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响

目的构建人骨唾液酸蛋白(BSP)正反义真核表达载体,研究其对骨肉瘤细胞侵袭转移特性的影响。方法以PCR的方法扩增人BSP的开放阅读框序列,与载体pIRES2-EGFP相连构成重组正反义表达质粒。以脂质体介导转染入MG-63细胞,通过Westernblot检测细胞中蛋白的表达。以重组基底膜侵袭实验和划痕实验测定对骨肉瘤细胞侵袭力的影响。结果成功构建了人BSP正反义核酸真核表达载体,转染后有效表达hBSP,与对照组相比,正义载体转染后使MG-63细胞中hBSP蛋白表达水平升高,侵袭力增强;反义载体转染后使MG-63细胞中hBSP蛋白表达水平降低,侵袭力受到抑制。结论BSP表达的改变可能在骨肉瘤的浸润转移过程中起重要作用,BSP表达下调可以抑制骨肉瘤的侵袭能力。

骨唾液酸蛋白与恶性肿瘤骨转移

骨骼是恶性肿瘤常见的转移部位之一。骨转移的诊断意义重大,它决定着患者的治疗方案和预后。临床上主要以影像学来评价有无骨转移发生,但其价格昂贵而且准确度差。临床医师正在寻找花费较低、可早期预示骨转移的标志物。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)作为一种溶骨性标志物在恶性肿瘤骨转移过程中起着重要作用,可作为评价是否出现骨转移,评估肿瘤有无进展,监测疗效的一项指标。本文对BSP结构、功能及其在恶性肿瘤骨转移中的作用进行综述。

骨唾液酸蛋白稳定性及成骨活性研究

目的对重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)进行稳定性及成骨活性研究,为进一步研究rhBSP功能活性,揭示相关病理机制奠定基础。方法Western blot检测rhBSP抗原性;SDS-PAGE蛋白电泳及毛细管电泳分析rhBSP的降解稳定性;碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测rhBSP对小鼠胚胎成骨细胞株(MC3T3-E1)ALP活性的影响。结果rhBSP能与BSP单抗稳定结合;rhBSP对温度敏感,在4和25℃极易降解,而在-20℃和冻干保存则相对稳定;rhBSP能提高MC3T3-E1细胞的ALP活性。结论rhBSP的稳定性主要受温度的影响,-20℃保存相对稳定;rhBSP可以促进MC3T3-E1细胞ALP的表达。

骨唾液酸蛋白通过整合素α_vβ_3调控ILK信号通路

旨在探究骨唾液酸蛋白(BSP)是否通过整合素αvβ3对整合素连接激酶(ILK)信号通路进行调控。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞,流式细胞仪在细胞水平检测BSP不同水平的细胞株中整合素αvβ3的表达量。Western blotting检测磷酸化ILK水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力。与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞中整合素αvβ3的表达水平明显下调(61.32±1.94)%(P<0.01)。整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体(LM609)处理前的BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(39.38±1.38)%(P<0.01);LM609处理后的231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(33.78±1.51)%(P<0.01)。向乳腺癌细胞231BO-scrambled和231BO-BSP27中添加LM609,MTT试验结果显示两株乳腺癌细胞的增殖能力均有降低(P<0.05)。BSP通过整合素αvβ3对乳腺癌MDA-MB-231细胞ILK信号通路进行调控,并影响细胞增殖。

骨唾液酸蛋白和基质金属蛋白酶-2在大鼠牙萌出过程中和种植支抗牙移动的实验模型的表达比较

目的：比较骨唾液酸蛋白（BSP）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在大鼠牙萌出过程中和应用种植支抗牙移动实验中的表达变化,探讨其在牙槽骨改建作用的机制.方法：牙萌出组实验材料取自出生后0、7、10、15d及21d的SD大鼠;建立应用种植支抗牵引大鼠下颌磨牙移动的实验模型（OTM组）,OTM组在大鼠右侧下颌做加力牵引,左侧下颌作为空白对照组,分别于OTM后2、4、7d及14d取材,H-E染色观察2组组织形态,免疫组织化学检测BSP及MMP-2表达变化及时间分布特点.结果：H-E染色显示,在牙萌出组牙相邻的牙槽骨中的骨小梁上可见成骨细胞及破骨细胞;OTM组中张力侧牙周膜间隙变宽,成骨细胞排列在骨小梁周围,压力侧间隙变窄,破骨细胞表达较多.免疫组织化学显示,BSP和MMP-2表达在牙萌出中牙槽骨的咬合区和根尖区域,在牙萌出早期和中期,两者阳性表达迅速增强,在10d达到高峰,后期仍维持较高水平;OTM组BSP和MMP-2分别表达在张力侧和压力侧,两者阳性细胞计数随牵引时间的延长而增加,OTM后7d达到高峰,此后逐渐降低;其时间分布变化趋势与牙萌出组相似.结论：在牙萌出及正畸牙移动过程中,BSP及MMP-2的表达规律与骨改建过程中成骨细胞、破骨细胞的分化、形成和功能密切相关,与牙槽骨改建过程一致,表明BSP及MMP-2在骨组织改建中起重要作用.

骨唾液酸蛋白与乳腺癌骨转移相关性的研究进展

多项研究已证实骨唾液酸蛋白(BSP)与乳腺癌骨转移具有相关性,而目前研究的热点是BSP诱导乳腺癌骨转移的具体作用机制及参与BSP基因表达调控的因子种类,这将为今后研究治疗骨转移相应靶向药物提供直接理论依据。同时将BSP与其他骨代谢指标如OPN、TRACP5b、NTx、PTHrP等联合检测可提高乳癌骨转移高风险人群筛选的精确性,并且这些因子可以作为乳腺癌的独立预后因素。

低浓度牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激骨唾液酸蛋白的基因表达和转录

目的研究低浓度牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对成骨细胞系(ROS17/2.8)中骨唾液酸蛋白(Bonesialoprotein,BSP)基因表达和转录的调节作用,以及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)转导途径阻断剂(U0126)对此调节作用的影响。方法0.01mg/LP.g·LPS作用ROS17/2.8细胞0h、3h、6h和12h后,用Northern杂交观察BSP和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)mRNA的表达;再将ROS17/2.8细胞随机分为四组:空白对照组、LPS(0.01mg/LP.g·LPS)组、U0126(5μmol/L)组、U0126+LPS组(U0126预刺激细胞30min后,U0126与P.g·LPS共同作用),各组持续作用12h后,用瞬时转染法分析BSP基因启动子的转录活性。结果0.01mg/LP.g·LPS作用ROS17/2.8细胞12小时后BSP和OPN的mRNA杂交条带增强;0.01mg/LP.g·LPS使BSP基因启动子(pLUC3)转录活性值与空白载体活性值的比值升高1.582(F=5.734,P<0.05),U0126使其降低2.693(F=11.500,P<0.01),U0126使LPS对比值的升高变化降低2.242(F=6.204,P<0.05)。结论低浓度(0.01mg/L)P.g·LPS增强ROS17/2.8细胞BSP基因表达和转录,而且其对BSP基因转录活性的上调作用是经由ERK1/2信号转导路径介导的。

骨唾液酸蛋白对乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移能力的影响

目的研究骨唾液酸蛋白（BSP）对乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移能力的影响及机制。方法通过划痕试验、Transwell侵袭实验、细胞黏附实验和反转录-聚合酶链反应等观察BSP对乳腺癌细胞MCF-7侵袭转移能力的影响。结果BSP稳定高表达可使MCF-7细胞的侵袭能力明显增加。稳定高表达BSP的MCF-7-BSP细胞与胶原和纤维连接蛋白的黏附性增加,其基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9表达也增强。结论BSP可以促进MCF-7细胞侵袭转移能力,其可能的机制是通过增加细胞的黏附性、促进MMP-2和uPA表达等。

人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的表达

目的构建人骨唾液酸蛋白(hBSP)正反义真核表达载体,并检测其在骨肉瘤细胞MG-63中的表达。方法以人骨膜细胞总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出hBSP全长序列,通过DNA重组技术构建hBSP正反义核酸真核表达载体,并用脂质体介导转染入MG-63细胞,通过RT-PCR及Western blot检测细胞中hBSP mRNA和蛋白的表达。结果成功构建了hBSP正反义核酸真核表达载体,转染后有效表达hBSP,正义载体转染后使MG-63细胞中hBSP mRNA和蛋白表达水平升高,反义载体转染后使MG-63细胞中hBSP mRNA和蛋白表达水平降低。结论转染正反义hBSP表达载体导致瘤细胞BSP表达的改变,为进一步实验研究提供了基础。