α_(1A)-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2稳定共表达细胞的构建

目的建立α_(1A)-肾上腺素能受体(α_(1A)-AR)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的活化T细胞核因子2(NFAT2)稳定共表达细胞。方法①将pcDNA3.1-α_(1A)-AR-3×FLAG重组质粒转染至U2OS-EGFPNFAT2细胞,经潮霉素B(Hygro-B)200 mg·L^(-1)压力筛选后加入α_(1A)-AR激动剂去甲肾上腺素(NE,10μmol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测细胞核内绿色荧光强度,验证EGFP-NFAT2核转位,筛选得到稳定表达α_(1A)-AR的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western印迹法检测该细胞和对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中α_(1A)-AR mRNA和蛋白的表达水平。③将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞接种于96孔板,分别加入NE(10^(-8)~10^(-5) mol·L^(-1))或α2-AR激动剂右美托咪定(DMED,10^^(-8.8)~10^(-5) mol·L^(-1))孵育30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位。④将U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞分为溶剂对照组、α1-AR拮抗剂萘派地尔(1μmol·L^(-1))组、NE(1μmol·L^(-1))组、萘派地尔+NE(各1μmol·L^(-1)共孵育)组、α2-AR拮抗剂阿替美唑(0.1μmol·L^(-1))组、DMED(0.1μmol·L^(-1))组、阿替美唑+DMED(各0.1μmol·L^(-1)共孵育)组和萘派地尔+DMED(萘派地尔1μmol·L^(-1)与DMED 0.1μmol·L^(-1)共孵育)组,药物孵育时间均为30 min,通过高内涵筛选系统检测EGFP-NFAT2核转位,验证该细胞α_(1A)-AR功能的特异性。结果①Hygro-B压力筛选得到58株U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞,NE 10μmol·L^(-1)孵育后,其中50号细胞核内绿色荧光强度最强,故选定其为稳定共表达α_(1A)-AR和EGFPNFAT2的U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞。②Western印迹法结果显示,U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞可明显表达α_(1A)-AR蛋白,而对照细胞U2OS-EGFP-NFAT2中未见α_(1A)-AR蛋白表达。RT-qPCR结果显示,该细胞在传代5~20代内α_(1A)-AR mRNA均稳定表达,其表达水平为对照细胞的500~800倍。③NE或DMED使U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞中EGFP-NFAT2核转位明显增加,半数有效浓度(EC50)分别为5.94×10^(-7)和6.15×10^(-8) mol·L^(-1)。④与溶剂对照组和萘派地尔组比较,NE组U2OS-EGFP-NFAT2-α_(1A)-AR细胞EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),而萘派地尔+NE组EGFP-NFAT2核转位较NE组明显减弱(P<0.01)。与溶剂对照组和阿替美唑组比较,DMED组EGFP-NFAT2核转位明显增强(P<0.01),阿替美唑+DMED组EGFP-NFAT2核转位与DMED组比较无明显差别,而萘派地尔+DMED组EGFP-NFAT2核转位较DMED组明显减弱(P<0.01)。结论成功构建稳定共表达α_(1A)-AR和EGFP-NFAT2的U2OS-EGFPNFAT2-α_(1A)-AR细胞,可用于靶向α_(1A)-AR化合物筛选和受体分子机制研究。

RNA特异腺苷脱氨酶1(p150亚型)抑制肝细胞脂质合成

目的:在油酸诱导的肝细胞脂肪变模型中,检测RNA特异腺苷脱氨酶1 p150亚型(ADAR1-p150)高表达细胞系中脂肪合成的变化。方法:利用本课题组前期摸索的油酸刺激人胚胎肝细胞L-02细胞系脂肪变的条件,q RT-PCR和Western-Blot检测油酸刺激组和对照组ADAR1-p150表达变化;将构建成功的ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control感染L-02细胞,检测感染细胞中ADAR1-p150的m RNA和蛋白表达水平;通过油红O染色和BODIPY染色观察L-02 ADAR1-p150和L-02 control细胞中脂滴形成,并进一步利用高内涵系统检测其荧光强度,对脂滴合成作定量分析。结果:L-02细胞在油酸刺激后ADAR1-p150的m RNA和蛋白水平降低;成功构建ADAR1-p150过表达慢病毒载体GV166-ADAR1-p150及空载体病毒GV166-control,q RT-PCR及Western-Blot检测显示病毒转染GV166-ADAR1-p150后ADAR1-p150在细胞中的表达水平显著升高;油红O染色和BODIPY染色发现L-02 ADAR1-p150较L-02 control细胞胞质中脂滴数量减少。高内涵筛选系统检测提示L-02 ADAR1-p150组中脂滴的荧光强度明显较L-02 control组低。结论:成功构建ADAR1-p150过表达稳定转染L-02细胞系,并证实高表达ADAR1-p150能够抑制脂肪合成。

Development of a high-content screening method to evaluate the cellular population-based biological activity of new siRNA delivering reagent

Normally, cellular responses to modified siRNAs or new siRNA delivery systems have been studied in group cell behavior by PCR, western blotting and fluorescence microscopy. In this study, we present a novel high-content screening （HCS） strategy to evaluate a novel delivery system （named CLD） of siRNA therapeutics, with which both the content of intracellular siRNAs and changes in protein expressing levels have been quantified in group cells and cellular population. We also observed that with the better cell uptake, CLD provided siRNA therapeutics （siBraf） better antitumor capability. This novel strategy was proved to be with efficiency, accuracy and high competency to adherent cell lines, thus making siRNA research more simplified.