目的基于实时细胞分析(real time cell analysis,RTCA)技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型(human adenovirus 3,HAdV-3)的作用进行毒/效整合分析,构建抗病毒药物高通量筛选的新策略。方法采用RTCA技术动态监测不同接种密度...目的基于实时细胞分析(real time cell analysis,RTCA)技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型(human adenovirus 3,HAdV-3)的作用进行毒/效整合分析,构建抗病毒药物高通量筛选的新策略。方法采用RTCA技术动态监测不同接种密度的A549细胞48 h生长曲线及10倍梯度稀释的HAdV-3感染A549细胞生长曲线,获得A549细胞最佳接种密度及HAdV-3最佳稀释浓度用于后续实验。以利巴韦林为阳性对照,基于RTCA技术采用曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)方法对5种中药挥发性组分的细胞毒性及抗HAdV-3的作用进行毒/效整合分析,并与传统终点法数据处理进行对比。结果终点法中艾叶、柴胡、薄荷、荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林对细胞的保护率分别为0.73%、12.50%、20.99%、44.50%、27.99%、51.50%和82.70%;AUC法中艾叶、柴胡、薄荷的选择性指数(Selective Index,SI)为负数,分别为-0.57、-0.21和-0.08。荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林的SI值分别为0.14、0.40、0.72和5.33。以利巴韦林的抗病毒活性为参照,终点法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的62.27%、33.85%和53.81%;AUC法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的13.51%、7.50%和2.63%。结论传统终点法与研究采用的AUC法计算结果有较大的差异。传统的抗病毒活性筛选研究多采用终点法检测受试药物对病毒感染细胞的保护作用,无法反映整个感染周期的变化,缺乏细胞毒的数据也会对结果的判断产生偏差。研究提示基于RTCA技术对中药挥发性组分开展抗HAdV-3的毒/效整合评价,采用AUC方法计算药物的选择性指数作为高通量筛选新策略,能快速、精准地判断受试药物的抗病毒活性,具有准确性高、重复性好的优势。展开更多
基于显色体系和破壁条件的优化,构建了酶解破壁与显色反应相结合的氨基酸脱氢酶突变体高通量筛选方法。以颜色和吸光度表征内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)酶活,以碘硝基四唑紫(INT)-吩嗪硫酸甲酯(PMS)为显色剂,通过其与StDAPD...基于显色体系和破壁条件的优化,构建了酶解破壁与显色反应相结合的氨基酸脱氢酶突变体高通量筛选方法。以颜色和吸光度表征内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)酶活,以碘硝基四唑紫(INT)-吩嗪硫酸甲酯(PMS)为显色剂,通过其与StDAPDH的偶联反应优化了显色体系;以StDAPDH酶活为评价指标,在单因素实验的基础上,采用响应面法探究了菌体量、破壁时间、溶菌酶加量对菌体破壁效果的影响。确定最优显色体系为:INT浓度0.1 mg·mL^(-1)、PMS浓度0.5μg·mL^(-1)、检测波长510 nm;确定最优菌体破壁条件为:30 mL OD 600值为1.5的菌悬液,离心后用10 mL PBS缓冲液重悬菌体沉淀,加入0.2 mg·mL^(-1)的溶菌酶,在37℃下破壁50 min。该方法简单高效,为氨基酸脱氢酶突变体的高通量筛选提供了一定参考。展开更多
双特异性抗体(BsAbs),简称双抗,是一种能同时结合两个不同靶点或表位的抗体,BsAbs在表达过程中通常伴随产生多种副产物,在纯化工艺中很难被去除。本研究运用高通量筛选技术,通过对SP Sepharose Fast Flow填料的纯化条件进行探索,建立基...双特异性抗体(BsAbs),简称双抗,是一种能同时结合两个不同靶点或表位的抗体,BsAbs在表达过程中通常伴随产生多种副产物,在纯化工艺中很难被去除。本研究运用高通量筛选技术,通过对SP Sepharose Fast Flow填料的纯化条件进行探索,建立基于Sepharose Fast Flow填料的双特异性抗体纯化方法开发的通用流程,每个筛选条件只需要0.4 mg双抗样品,可同时筛选多达32个条件,筛选过程总耗时2 h,而传统柱层析需耗时64 h。通过高通量迅速筛选方法可以有效去除双抗分子副产物,为解决纯化工艺难题提供了一种新的工艺路线。展开更多
文摘目的基于实时细胞分析(real time cell analysis,RTCA)技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型(human adenovirus 3,HAdV-3)的作用进行毒/效整合分析,构建抗病毒药物高通量筛选的新策略。方法采用RTCA技术动态监测不同接种密度的A549细胞48 h生长曲线及10倍梯度稀释的HAdV-3感染A549细胞生长曲线,获得A549细胞最佳接种密度及HAdV-3最佳稀释浓度用于后续实验。以利巴韦林为阳性对照,基于RTCA技术采用曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)方法对5种中药挥发性组分的细胞毒性及抗HAdV-3的作用进行毒/效整合分析,并与传统终点法数据处理进行对比。结果终点法中艾叶、柴胡、薄荷、荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林对细胞的保护率分别为0.73%、12.50%、20.99%、44.50%、27.99%、51.50%和82.70%;AUC法中艾叶、柴胡、薄荷的选择性指数(Selective Index,SI)为负数,分别为-0.57、-0.21和-0.08。荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林的SI值分别为0.14、0.40、0.72和5.33。以利巴韦林的抗病毒活性为参照,终点法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的62.27%、33.85%和53.81%;AUC法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的13.51%、7.50%和2.63%。结论传统终点法与研究采用的AUC法计算结果有较大的差异。传统的抗病毒活性筛选研究多采用终点法检测受试药物对病毒感染细胞的保护作用,无法反映整个感染周期的变化,缺乏细胞毒的数据也会对结果的判断产生偏差。研究提示基于RTCA技术对中药挥发性组分开展抗HAdV-3的毒/效整合评价,采用AUC方法计算药物的选择性指数作为高通量筛选新策略,能快速、精准地判断受试药物的抗病毒活性,具有准确性高、重复性好的优势。
文摘基于显色体系和破壁条件的优化,构建了酶解破壁与显色反应相结合的氨基酸脱氢酶突变体高通量筛选方法。以颜色和吸光度表征内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶(StDAPDH)酶活,以碘硝基四唑紫(INT)-吩嗪硫酸甲酯(PMS)为显色剂,通过其与StDAPDH的偶联反应优化了显色体系;以StDAPDH酶活为评价指标,在单因素实验的基础上,采用响应面法探究了菌体量、破壁时间、溶菌酶加量对菌体破壁效果的影响。确定最优显色体系为:INT浓度0.1 mg·mL^(-1)、PMS浓度0.5μg·mL^(-1)、检测波长510 nm;确定最优菌体破壁条件为:30 mL OD 600值为1.5的菌悬液,离心后用10 mL PBS缓冲液重悬菌体沉淀,加入0.2 mg·mL^(-1)的溶菌酶,在37℃下破壁50 min。该方法简单高效,为氨基酸脱氢酶突变体的高通量筛选提供了一定参考。
文摘双特异性抗体(BsAbs),简称双抗,是一种能同时结合两个不同靶点或表位的抗体,BsAbs在表达过程中通常伴随产生多种副产物,在纯化工艺中很难被去除。本研究运用高通量筛选技术,通过对SP Sepharose Fast Flow填料的纯化条件进行探索,建立基于Sepharose Fast Flow填料的双特异性抗体纯化方法开发的通用流程,每个筛选条件只需要0.4 mg双抗样品,可同时筛选多达32个条件,筛选过程总耗时2 h,而传统柱层析需耗时64 h。通过高通量迅速筛选方法可以有效去除双抗分子副产物,为解决纯化工艺难题提供了一种新的工艺路线。
