植物三萜皂苷生物合成及关键酶鲨烯合酶的研究进展

三萜皂苷(triterpenoid saponins)是一类重要的植物次生代谢产物,有抗菌和抗虫害的作用,可用作药物,具有重要的商业价值.三萜皂苷含量和组成的变化又取决于三萜皂苷合成途径中的一些关键酶及其在细胞中的表达水平.鲨烯合酶(Squalene syntase,SS)是三萜皂苷生物合成的第一个关键酶,其含量和活性决定了后续产物的产量.因而若能在分子水平上实现对SS的调控,将为人工大量生产三萜皂苷提供可能.全文综述了三萜皂苷的生物合成途径及该途径的关键SS的研究进展.

三七鲨烯合酶基因在三七根、茎、芦头中的转录表达与三萜皂苷合成

三萜皂苷是三七、人参等重要药用植物的主要有效成分.采用改进的异硫氰酸胍法提取到三七RNA,经RT-PCR克隆技术获得三七三萜合成通路关键酶之一鲨烯合酶(squalene synthase,SS)cDNA,长1270 bp,读码框架编码415个氨基酸.比对分析表明,推衍的三七SS氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥和水稻SS的一致性分别为98%、89%、81%、78%和71%.利用实时荧光定量RT-PCR技术对三七根、茎、芦头的SS转录表达研究发现,一年生三七根SS基因转录表达量最高,高于茎和芦头的表达;但总皂苷含量是:芦头>叶>根>茎.可能与SS之后其它三萜合成关键酶的活性差异或/和三萜合成后的定向输送及累积有关.

金铁锁鲨烯合酶cDNA的克隆和功能鉴定

濒危药用植物金铁锁(Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu.)的有效成分三萜总皂苷有显著的药理活性。为克隆和鉴定金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因——鲨烯合酶的全长cDNA,本研究采用同源兼并引物PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了其全长cDNA;结合大肠杆菌异源表达、体外酶促反应及针对产物化学结构的GC和GC-MS分析等方法鉴定了其功能。研究结果表明:金铁锁鲨烯合酶cDNA全长为1 663bp,含有1 245 bp的开放阅读框(ORF),编码414个氨基酸(计算分子质量为47.69 kD),5′非编码区(UTR)和3′UTR分别为260 bp和158 bp,GenBank注册号为EF585250,与三七、人参和甘草的鲨烯合酶的氨基酸序列有较高的同源性,分别为83%、82%和82%,而与裂变酵母、白色念珠菌和人的氨基酸序列的同源性分别只有35%、39%和47%;表达产物具有催化两分子法呢烯焦磷酸连接成鲨烯的活性。本研究克隆和鉴定了金铁锁鲨烯合酶的全长cDNA,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要基础。

刺五加鲨烯合酶基因家族两成员的表达及其与皂苷含量的关系

为了探明刺五加鲨烯合酶(SS)基因家族2成员对皂苷含量的作用机制,以actin为内参基因,利用real time PCR技术,分析刺五加不同生长发育时期、不同器官及茉莉酸甲酯(MeJA)处理对SS1、SS2基因表达及皂苷含量的影响。结果表明:刺五加SS基因家族的SS1和SS2在整个生长期和各器官中均有表达,且表达量差异显著(P<0.05),其中,在萌芽期两者的表达量差异最大。SS1在叶片、叶柄和根器官中的表达量显著高于SS2的表达量(P<0.05)。MeJA处理可显著提高SS1和SS2基因的表达量。刺五加SS1的表达量与皂苷含量间的相关系数低,未达显著水平。SS2的表达量与皂苷含量呈显著的正相关关系(P<0.01)。SS2表达量的高低决定了皂苷含量的高低,是刺五加中三萜皂苷生物合成中的关键酶。

陆生植物鲨烯合酶适应性进化正选择位点分析

鲨烯合酶是三萜类皂苷生物合成途径中的关键酶,其活性的高低决定了三萜皂苷、植物甾醇等后续次生代谢物的含量.对鲨烯合酶进行正选择位点分析,可为识别重要的功能位点提供有意义的信息.本研究在克隆获得五加科三七、葫芦科绞股蓝鲨烯合酶cDNA的基础上,结合GenBank中所登载的植物鲨烯合酶cDNA序列信息,利用位点模型检测并分析了38种陆生植物鲨烯合酶的适应性进化.结果显示,进化上相对保守的鲨烯合酶受到正选择作用,检测到的21个正选择位点大部分集中于第2跨膜区及其两侧,其中189S、194S、196S、265I、389P、390T、408A、410R和414N等9个位点很可能与鲨烯合酶的活性有关.本研究从分子进化角度为调控三萜类化合物的生物合成提供了一个新的思路.

中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定

利用PCR方法,将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464)开放阅读框的3′末端截短99bp,插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间,构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA.将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)28℃诱导重组鲨烯合酶的表达.表达产物经镍琼脂糖柱纯化.纯化蛋白加入酶促反应体系(含FPP和NADPH),GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物,结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化.青蒿鲨烯合酶的功能鉴定为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成,从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础.

刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情况;还利用SPSS 17.0软件分析了SS基因的表达量与刺五加中皂苷总含量的相关性。结果表明,在刺五加的整个生长期中,SS基因的表达量呈现出"低—高—低—高—低"的变化趋势:萌芽期(4月26日)该基因的表达量最低,而盛花期(6月26日)该基因的表达量最高,为萌芽期的3.11倍;SS基因在刺五加根中的表达量显著高于茎、叶和叶柄中的表达量(P<0.05),其在茎中的表达量最低,仅为根中表达量的51.88%。茉莉酸甲酯可提高SS基因的表达量,但其与对照组的差异未达到显著水平。刺五加中的皂苷总含量与SS基因的表达量间呈现出同升同降的变化趋势,存在极显著的正相关关系(P<0.01)。文中初步判定,鲨烯合酶是刺五加皂苷生物合成的关键酶。

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthasegene,SS)cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列。克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73%、97.59%和96.63%。首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考。

麻疯树鲨烯合酶基因SQS的克隆及生物信息学分析

以麻疯树(Jatropha curcas L.)总RNA为模板,根据已报道的鲨烯合酶基因序列设计简并引物,用RACE方法克隆得到麻疯树鲨烯合酶基因全长cDNA,命名为JcSQS。JcSQS全长1609 bp,包含1个1242 bp的开放阅读框,预测麻疯树鲨烯合酶基因编码的蛋白含有413个氨基酸。JcSQS具有鲨烯合酶类的保守结构域,JcSQS蛋白与蓖麻、柿、木榄等植物中SQS基因编码的氨基酸序列具有高度同源性。这为研究麻疯树萜烯类物质的生物合成和调控机制奠定了基础。

鲨烯合酶基因的密码子偏性分析

为了分析鲨烯合酶（squalenesynthase，ss）基因密码子的使用方式及其影响因素，利用codonW和SPSS16．0软件对47条来自不同物种的嬲基因进行多元统计分析、对应性分析。髂基因密码子1～3位碱基的GC含量（GC1，GC2和GC3）依次为51．33％、34．65％和54．37％，3个位点的GC含量均呈极显著相关关系（p〈0．01），对应性分析的结果表明，第1轴显示30．71％的差异，有效密码子数和GC3、GC1和GC2的均值与GC3之间的相关性均达极显著水平（p〈0．01）。筛选出的26个最优密码子的第3位碱基均为G或C。以MEGA5．0构建的基于SS蛋白质序列的进化树比基于RSCU的聚类更符合传统的系统发育观点。SS基因密码子偏好以G／C结尾，使用模式受选择和突变影响，突变对密码子偏好影响较大。

裂殖壶菌鲨烯合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为探讨裂殖壶菌烯合酶基因的克隆,以及在大肠杆菌中的表达。采用简并引物与RACE相结合的方法从裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鲨烯合酶基因。分析表明该基因的cDNA全长包括1672个核苷酸,编码一个含446个氨基酸的开放阅读框;在裂殖壶菌中以单拷贝的形式存在。同源分析显示裂殖壶菌鲨烯合酶的氨基酸序列中含有5个保守基序。将裂殖壶菌鲨烯合酶的cDNA序列连接到原核表达载体pGEX-4T-3上构建融合表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,其相对分子质量与预期相符;且融合蛋白具有一定的免疫原性。

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS)是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总RNA,利用RT-PCR以及RACE的方法克隆橡胶树鲨烯合酶cDNA编码区片段,并进行序列分析。结果表明:橡胶树鲨烯合酶cDNA编码区为1 239bp,编码413个氨基酸,命名为HbSQS。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。

甜瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物,目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶(SQS)的基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明:DNA测序和BLASTRefSeqGene分析表明,克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架(ORF)序列。ORF分析显示,甜瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示,该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明,SQS属于异戊二烯合酶家族,具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示,甜瓜SQS为单体酶,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示,S^(48)处于酶活性中心相关^(47)VSRSF^(52)的模体中,而S^(196)是正选择位点,提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。

刺五加鲨烯合酶基因2 cDNA的克隆与蛋白结构分析

采用RT-PCR和RACE法克隆了刺五加鲨烯合酶基因2(squalene synthase gene 2,SS2)cDNA的全长序列(GenBank登录号:JN714465)。该序列全长1 463bp,其中5’端非翻译区长10bp,3’端非翻译区长208bp,开放阅读框长1 245bp,编码414个氨基酸。该蛋白具有1个Trans_IPPS_HH保守区域、2个鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶特异性识别区域及2个跨膜区。氨基酸序列比对结果表明,该蛋白与五加科其它植物SS的一致性均大于90%,与刺五加SS1的一致性为91.79%。

油茶种仁鲨烯合酶基因的分子特性与表达分析

角鲨烯含量是高品质植物食用油评判标准的重要指标之一。鲨烯合酶是角鲨烯合成直接相关的上游调控关键酶。本研究在已构建的油茶种仁转录组数据库基础上,设计特异引物,采用RACE技术获得油茶鲨烯合酶基因的全长cDNA序列,命名为CoSQS(Gen Bank登录号为JX914592)。生物信息学分析结果表明:该序列全长1554 bp,其中含全长的开放阅读框为1245 bp,编码415个氨基酸残基,CoSQS蛋白为弱碱性非分泌型蛋白,具有2个明显的跨膜区和2个角鲨烯和番茄红素合成酶的特异信号区。与柿Dk SQS同源蛋白亲缘关系最近,属于疏水性蛋白。亚细胞定位试验结果显示该基因定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,5-10月间,油茶种仁中CoSQS基因表达量呈现先上升后下降的趋势,转录最高峰在9月下旬。通过关联分析表明CoSQS基因表达量与角鲨烯含量密切相关。

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。

人参属植物鲨烯合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

利用生物信息学方法对GenBank中人参属9种植物鲨烯合酶的cDNA序列以及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域功能域和进化关系进行了初步预测和分析。结果表明:总体上人参属鲨烯合酶核苷酸序列相似性平均为96.245%,氨基酸相似性平均为95.5%。其二级结构预测结果显示9个鲨烯合酶氨基酸序列以α螺旋和无规则卷曲为主要组成部分。对9种人参属植物进行进化树分析发现可以分为2个亚族。对包括人参属9种植物在内的其他物种进行进化树分析可知,植物、动物、酵母分属不同的类群。通过分析人参属植物鲨烯合酶及其编码基因的生物信息学特征,可以为鲨烯合酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。

枇杷鲨烯合酶(Squalene synthase)基因的克隆及序列分析

鲨烯合酶（SQS）是枇杷三萜酸生物合成过程中的关键酶。以枇杷（Eriobotrya iaponicn L．）悬浮培养细胞为材料，采用RT—PCR和RACE方法分离得到枇杷鲨烯合酶Ej-SQS（Squalene svnthase）基因的cDNA全长序列（GenBank，JQ294055），共1775bp，包含了5’非编码区为97bp，开放阅读框为1239bp，3’非编码区为439bp。该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列（含412个氨基酸）与其它植物SQS具有79％～94％同源性．包含Trans_IPPS_HH保守结构域，可能属于Isoprenoid Biosynthesis enzymes，Class 1家族。为今后利用基因工程调控枇杷细胞悬浮培养物以提取目标产物奠定基础。

啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

【目的】克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子。【结果】通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定。【结论】成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体。