采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒 (ILTV)的二温式聚合酶链反应 (二温式PCR) ,根据已报道的ILTVTK基因的序列 ,设计并合成了 1对引物 ,用二温式PCR对 5株不同ILTVDNA进行扩增。该对引物对 5株ILTVDNA均扩增出与预期大小相一致的 64 7bp的扩增产物 ,而对新城疫病毒 (NDV )、传染性支气管炎病毒 (IBV)、禽呼肠孤病毒 (ARV)、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等 6种禽病病原体的扩增 ,结果全部为阴性。该二温式PCR可检测到 1fg的ILTVDNA模板 ,其敏感性比常规三温式PCR高 1万倍。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

鸡传染性喉气管炎病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立

旨在建立检测鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)绝对定量方法。根据已发表的鸡ILTV的TK基因序列,针对其保守区域分别设计1对特异引物和1条探针,建立检测鸡ILTV的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,建立方法的最佳引物浓度为20μmol/μL,最佳探针浓度为10μmol/μL,最佳退火温度为56℃。特异性检测结果显示,建立的方法只检出ILTV,没有检出其他病原株。敏感性检测结果显示,采用建立的方法定量检出ILTV重组质粒标准品的最低限为4.6拷贝/μL。对3个连续稀释的pMD18-ILTV重组质粒DNA进行检测,3次重复检测结果的变异系数均小于5%。对83份病鸡喉拭子、肺及脾组织样品进行检测,采用建立的ddPCR检出ILTV阳性样品10份,荧光定量PCR检出ILTV阳性样品9份,ddPCR的阳性检出率(12.05%)高于荧光定量PCR的阳性检出率(10.84%)。结果表明,建立的ddPCR方法定量检测ILTV特异性强、敏感性高、重复性好,为绝对定量检测ILTV提供更好的技术支撑。

1株鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定及致病性评价

研究旨在为当前国内鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)的流行情况调查及相关疫苗研发提供参考。河南省濮阳市某养鸡场的蛋鸡疑似感染ILTV,将阳性病料处理后接种鸡胚绒毛尿囊膜,盲传3代后产物进行PCR鉴定和TK、gD基因序列测定分析,并通过动物回归试验初步研究分离株的致病性。结果显示,盲传3代后绒毛尿囊膜出现痘斑、增厚现象,产物PCR鉴定结果为阳性,将其命名为PY株。PY株TK、gD核苷酸序列与GenBank发表的ILTV序列相似性分别为99.4%~100.0%、99.1%~100.0%。49日龄SPF鸡于攻毒后第3 d出现鸡传染性喉气管炎的典型临床症状,剖检病死鸡可见喉头气管内充满血样黏液。攻毒后鸡发病率为100%、死亡率为30%。研究表明,分离株PY株是一株致病力较强的ILTV。

应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV、ILTV和MG 4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库 ,设计了 4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA或DNA模板进行多重PCR扩增 ,结果均同时得到了 4条特异性大小与实验设计相符的 310bp(NDV)、172 0bp(IBV)、6 47bp(ILTV)、和 732bp(MG)多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性 ;敏感性测定结果表明 ,该多重PCR技术能检出 10pg的IBV、1pg的NDVRNA模板和 10pg的ILTV、1pg的MGDNA模板。

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗株糖蛋白gB基因序列比较分析

根据已经发表的鸡传染性喉气管炎病毒 ( ILTV) SA2 株的 g B基因序列 ,设计了 1对引物 ,通过 PCR扩增了 ILTV王岗株的 g B基因 ,并克隆到 p UC1 1 9质粒的 Eco R 位点中 ,经酶切鉴定证实后 ,进行了序列测定。结果表明 ,g B基因长 2 6 1 9bp,包含完整的阅读框架。序列比较分析表明 ,ILTV王岗株的 g B基因核苷酸序列与英国的 Throne882和美国的 6 32 2个强毒株的 g B基因序列完全一致 ,而与澳大利亚 SA2 疫苗株g B基因核苷酸同一性为 99.8% ,氨基酸的同一性为 98.4 %。与澳大利亚 SA2 疫苗株 g B基因核苷酸和氨基酸序列比较发现 ,ILTV 3个强毒株 (王岗株 ,Throne 882株和 6 32株 ) g B基因的核苷酸序列在第 89位上均缺失 1个碱基 G,而在第 1 0 2位核苷酸处又插入了 1个碱基 A,从而引起了在氨基酸序列中第 2 9～ 32位 5个氨基酸的移码突变。

鸡传染性喉气管炎病毒TaqMan real-time PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TaqMan Real-time PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的ILTV gB基因序列设计了2对引物与一条特异性TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件的优化,特异性、敏感性以及重复性试验,证明该方法在核酸含量108拷贝/μL～101拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;能够检测初始模板中10-3EID50的病毒核酸及16拷贝的标准品;与其它相关的鸡源病毒均无交叉反应,并且批内、批间变异系数均小于2%,具有良好的重复性。该检测方法的建立为ILTV的临床检测和定量分析提供了一种快速、准确的技术手段。

应用聚合酶链反应扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因的研究

根据鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)TK基因的核苷酸序列设计并合成 1对引物 ,用该引物对 4株不同的ILTV进行PCR扩增。结果全部ILTV毒株均获得与试验设计相符的 64 7bp的扩增片段 ,而对其它 6种禽病原体的扩增结果均为阴性 ;敏感试验表明 ,该引物能检出 10pg的ILTVDNA。

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病。在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件。在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护。在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体。这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播。

鸡传染性喉气管炎病毒实时荧光PCR检测方法的建立与应用

为探索适合临床高通量鸡传染性喉气管炎检测的方法,针对鸡传染性喉气管炎病毒gB基因序列保守区域,筛选1对特异性引物和1条特异性探针,建立了实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性评估和临床应用检测。结果显示:筛选出的引物和探针与其他禽类常见病毒无交叉反应,检测下限达到100拷贝/反应;对来自13个场的480份临床样本进行检测,检测出17个阳性样品,与常规PCR检测结果符合率为100%。结果表明,此方法特异性强,灵敏度高、耗时少,可用于鸡传染性喉气管炎的快速检测。

鸡传染性喉气管炎病毒(江苏株)的分离与初步鉴定

本研究从江苏省某养鸡场采集临床疑似鸡传染性喉气管炎(infectious laryngotracheitis,ILT)的病鸡喉头气管,接种鸡胚绒毛尿囊膜分离病毒,命名为LJS091151。以分离毒人工感染SPF鸡,于攻毒后d3出现了ILT的典型临床症状,剖检亦可见喉头气管黏膜充血肿胀、消化道空虚、黏膜充血等病理变化。根据GenBank发表的鸡传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitis virus,ILT)gB、TK基因保守序列设计2对引物对分离株基因组DNA进行扩增和序列测定。序列分析表明,获得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与GenBank发表的序列相似性均在99%以上,证明了分离株LJS091151为鸡传染性喉气管炎病毒。

鸡传染性喉气管炎病毒地方株的分离鉴定

对河南荥阳某养鸡场发病鸡喉头和气管等病料进行病毒分离,采用鸡胚尿囊膜接种和琼脂扩散试验对分离病毒进行鉴定。结果表明,所分离病毒为鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV),获得了1株ILTV河南分离株。参考GenBank收录的鸡传染性喉气管炎病毒基因序列设计、并合成1对引物,以ILTV地方分离株的DNA为模板,PCR扩增出1条特异性条带,测序结果与GenBank收录序列的同源性达99.9%,说明分离病毒的这一段DNA序列相对保守。

两株鸡传染性喉气管炎病毒的分离与鉴定

从河南省长葛、荥阳等地采集的病鸡(临床疑似感染ILTV)喉气管组织中分离得到两株病毒,暂命名为ILTV-CG和ILTV-XY。经人工接种易感鸡,ILTV-CG组于接种后第四天I、LTV-XY组于接种后第三天部分鸡只死亡,并可致死部分鸡胚,绒毛尿囊膜增厚且有大小不等、数量不一的白色痘斑;两株病毒对乙醚、氯仿敏感;在电镜下可观察到六边形、二十面体对称、有囊膜、具空心颗粒的病毒粒子;根据GenBank中收录的ILTV TK基因核苷酸序列,设计一对特异引物,以两病毒株及参考株的DNA为模板进行PCR反应,均扩增出完全一致的特异带,扩增产物用EcoRⅠ酶切后的酶切图谱也完全一致。试验结果表明两分离株均为ILTV。

应用PCR检测鸡传染性喉气管炎病毒

根据传染性喉气管炎病毒（ILTV）TK基因序列,设计、合成1对引物,应用PCR技术对ILTV以色列疫苗株、河南分离株（ILTV-CG和ILTV-XY）进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的目的片段,测序分析和酶切分析证实了PCR产物的特异性,而对其它禽病原体的扩增均为阴性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为21 pg。应用PCR检测人工接种后不同天数采集的鸡的结膜拭子,接种后第2-5 d均能检测到ILTV。该方法可用于鸡传染性喉气管炎病的诊断和临诊样品检测。

鸡传染性喉气管炎病毒河南株gB基因真核表达载体的构建及表达

根据已发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因序列,设计并合成1对引物,以河南分离株(ILTV-HN)接种10日龄鸡胚,从含痘斑的绒毛尿囊膜中提取基因组DNA扩增gB基因,将扩增片段克隆入pGEM-TEasy载体后,经蓝白斑筛选,菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序,结果表明克隆到ILTV-HN株gB基因,全长为2 629 bp,包含一个完整的开放阅读框。然后将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-gB,转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过RT-PCR检测,转染细胞中含gB基因的mR-NA,间接免疫荧光检测,结果表明gB基因在CEF细胞中进行了瞬时表达。

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因的表达及间接ELISA检测方法的初步建立

将含有ILTVgD糖蛋白基因的重组质粒pMD-T-gD用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,回收目的片段,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-gD。将pET-gD转化到宿主表达菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示表达目的蛋白大小为55 000,Western blotting表明表达产物具有良好的免疫原性。表达的蛋白产物经纯化后作为ELISA包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG作为二抗,初步建立了间接ELISA诊断方法,并确定了抗原最佳包被浓度为24.5 mg/L;最佳血清稀释度为1∶80,初步确定ELISA判定标准为D450≥0.25判为阳性,小于0.25为阴性。

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其原核表达

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因序列和表达载体pBV221的多克隆位点,设计了1对引物。以ILTV疫苗株基因组为模板,应用PCR扩增出gB基因片段,然后将其定向克隆于原核表达载体pBV221中,构建了重组质粒pBV-gB。重组质粒转化到受体菌DH5α中,得到阳性重组菌株DH5α(pBV-gB)。该菌株在温控诱导下,SDS-PAGE电泳可见表达的特异蛋白。ELISA检测证明,表达的蛋白具有较好的反应原性。