鸡Caspase3基因的克隆表达、酶活性及生物信息学分析

【目的】构建鸡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(chCaspase 3)基因表达载体,鉴定表达蛋白酶活性,并进行生物信息学分析,为后续研究chCaspase 3功能奠定基础。【方法】以鸡法氏囊组织cDNA为模板,通过PCR扩增chCaspase 3基因,构建chCaspase 3基因的原核和真核表达载体。将原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白后利用Western blotting分析chCaspase 3原核表达产物。将真核表达载体以不同剂量(0、0.5、1.0、1.5、2.0μg)转染DF-1细胞进行表达,利用Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)分析chCaspase 3真核表达产物。用Caspase 3活性检测试剂盒分别检测原核和真核表达蛋白的酶活性;利用生物信息学软件分析chCaspase 3的相似性,并预测chCaspase 3蛋白的结构域和三级结构。【结果】chCaspase 3基因CDS区长852 bp,编码283个氨基酸。本研究成功构建了原核pET28a(+)-chCaspase 3和真核p3×Flag-CMV7.1-chCaspase 3重组质粒,原核表达产物分子质量为36 ku,与预期相符;真核表达产物表达量随转染的真核表达载体量的增加而增加。原核和真核表达产物均具有Caspase 3酶活性。生物信息学分析发现,chCaspase 3与其他物种相似性较低,且亲缘关系较远,chCaspase 3蛋白含有Caspase家族的保守五肽QACRG和经典的CASc结构域,其三维结构与人Caspase 3(hCaspase 3)十分吻合。【结论】试验成功克隆并表达了chCaspase 3基因,重组蛋白具有Caspase 3酶活性,生物信息学预测chCaspase 3蛋白与hCaspase 3蛋白有相似的三维结构,为揭示chCaspase 3蛋白的功能及探索其抗病毒天然免疫机制奠定了基础。