麻疹病毒L4株血凝素基因的克隆与表达及免疫原性

从部分减毒的麻疹病毒Ｌ４株感染的Ｖｅｒｏ细胞中提取ｍＲＮＡ、进行逆转录及ＰＣＲ扩增。克隆到了长１．９ｋｂ的４个血凝素基因克隆。ＤＮＡ序列分析发现，Ｌ４株的血凝素基因有４个碱基与Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株不一致，造成３个氨基酸差异。这４个克隆在重组痘苗中表达后，３个克隆的表达产物均表现出良好的血凝活性、助融合活性（Ｆｕｓｉｏｎｈｅｌｐｅｒ）和较强的免疫原性。表达血凝素分子量分别为未糖化的６８ｋＤ以及糖化的７９ｋＤ分子，免疫的兔血清显示出较高的ＥＬＩＳＡ（１：８００）～１：３２００）、ＨＩ（１：１６０－：１：１２８０）、ＨＬＩ（１：１６０～１：６４０）及ＮＴ（１：１００～１：４８６）滴度。麻疹病毒ＬＡ株的血凝素基因的克隆为麻疹重组疫苗的研究提供了重要材料。

自制捕获法ELISA抗麻疹病毒-IgM诊断试剂盒的初步评价

目的初步评价应用自制抗麻疹病毒（抗MV）单克隆抗体（McAB；单抗）及其酶结合物研制的捕获法ELISA抗MV-IgM诊断试剂盒。方法考核本试剂盒的特异性和稳定性；比较其与同类商品试剂盒的临床检测结果，以评估检测血清抗MV-IgM的敏感性。结果①本试剂盒仅与抗MV-IgM阳性血清发生反应，而与抗甲型肝炎病毒-IgM（抗HAV-IgM）、抗乙型脑炎病毒-IgM（抗JEV-IgM）、抗乙型肝炎病毒核心-IgM（抗HBc-IgM）、抗巨细胞病毒-IgM（抗CMV-IgM）、抗EB病毒-IgM（抗EBV-IgM）及类风湿因子（RF）阳性血清均无反应；试剂盒放置37℃ 3d，检测血清抗MV-IgM的活性，无明显降低。②在39例临床疑似麻疹的56份血清中，两种试剂盒仅对8例的8份血清抗MV-IgM检测结果不一致，其中6例的首份血清，本试剂盒阳性，商品试剂盒阴性（第2份血清两种试剂盒均阳性），1例的首份血清（未采到第2份血清），本试剂盒为临界值，商品试剂盒阴性。另1例的第2份血清本室试剂盒阳性，商品试剂盒阴性（两种试剂盒首份血清均阴性，第3份血清均阳性）。结论本实验室研制的捕获法ELISA抗MV-IgM诊断试剂盒具有良好的特异性、稳定性和敏感性，适于麻疹病毒感染的临床诊断和流行病学监测。

中国6省2005年麻疹病毒分离株分子特征分析

研究2005年我国6省麻疹暴发、流行的野毒株基因型特征和分子流行病学,为进一步的麻疹防治策略提供科学依据.用RT-PCR方法,从2005年6省分离的48株麻疹病毒株中扩增出核蛋白(nucleoprotein, N)基因C末端676个核苷酸片段.再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析.6省分离的48株麻疹病毒均为H1基因型,其中两株为H1b亚型, 其余为H1a亚型.48株野毒株的核苷酸同源性为95.1%～100%(核苷酸差异为0～22bp),氨基酸同源性为92.7%～100%;与我国疫苗株S191的核苷酸同源性为88.7%～92.5%,氨基酸同源性为88.0%～91.2%.其中Shaanxi05-1和Yunnan05-1,Anhui05-2和Ningxia05-9的N末端456个核苷酸的同源性为100%;Hebei05-19、Anhui00-2和Liaoning02-2,Hebei05-1和Chongqing04-3的核苷酸的同源性为100%.引起2005年我国6省麻疹暴发流行的野毒株为H1基因型,并以H1a为绝对优势亚型.各省之间存在相同毒株引起的传播链,不同年份之间存在相同麻疹野毒株的持续循环传播.同时提示,有必要进一步研究由核苷酸变异引起的氨基酸变异及中和抗原位点等生物学性状的改变,可能影响麻疹病毒的毒力和传播力.

麻疹病毒抗原性变异及免疫保护效果研究

目的 了解浙江省麻疹野毒株的抗原性变异状况以及麻疹疫苗的免疫保护效果。方法 采用麻疹国际标准株Edmonston株、疫苗株沪191与近几年浙江省分离的麻疹野毒株 (浙 98- 5和浙 0 0 - 4 )分别制备免疫血清 ,与各毒株进行交叉中和试验 ,并分别对不同来源的人群血清测定中和抗体滴度。结果 麻疹野毒株浙 98- 5与疫苗株沪191和Edm株的抗原比分别为 3 0和 2 6 ,浙 0 0 - 4与上述两毒株的抗原比分别为 7 30和 5 6 5 ,其抗原性存在着明显的差异。麻疹疫苗初免儿童和麻疹急性期病人血清对麻疹野毒株的中和抗体几何平均滴度 (GMT)分别为 15 0 3和 5 0 4 ,明显低于疫苗株沪191,GMT分别为 6 8 12和 11 76。但健康人群血清对两毒株的中和抗体滴度无显著性差异。结论 浙江省麻疹野毒株已出现较明显的抗原性变异 ,现行麻疹疫苗的免疫保护效果也受到一定影响。

同时表达麻疹病毒L4株HA和F蛋白及人白细胞介素2(IL2)的重组痘苗病毒疫苗株的构建

构建了同时表达麻疹病毒ＬＡ株ＨＡ和Ｆ基因及人白细胞介素２（ＩＬ２）的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２。Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ结果显示，ＨＡ、Ｆ和人ＩＬ２基因均在痘苗病毒中稳定有效表达，且产物与天然蛋白相近。ＨＡ分子有糖化的７９ｋＤ和非糖化的田ｋＤ两种形式；Ｆ分子以６０ｋＤ的前体Ｆ０、４３ｋＤ的Ｆ１和１８ｋＤ的Ｆ２三种形式存在。表达产物的血凝效价为１：８，血溶活性ＯＤ５４０的测定结果是Ｏ３７。该重组病毒免疫新西兰白兔及Ｃ５７小鼠，可以产生抗麻诊病毒ＨＡ和Ｆ蛋白的特异性ＥＬＩＳＡ（１：６４４～１６００）、血凝抑制（１：２５６～５１２）、血溶抑制（１：８０～１６０）和ＮＴ（１：６４０）抗体。接种兔及裸鼠后的毒力反应，明显低于只表达ＩＬ２的重组痘苗病毒疫苗株ＲＶＪ１２３，表现为兔皮肤红肿范围小，持续时间短，皮肤无坏死；裸鼠毒力的结果，表现出ＲＶＪＭＬＨＡＦＫＩＬ２病毒只存留于接种局部，而且滴度大大降低，未发现该病毒向其它脏器播散和增殖。麻疹重组痘苗病毒疫苗株的构建为该疫苗株的人体免疫观察奠定了基础。

陕西省麻疹病毒基因分型及疫苗免疫因素分析

目的确定引起陕西省麻疹流行的病原毒株,探讨相关的疫苗免疫因素。方法采集麻疹病人咽拭子标本分离病毒,用酚-氯仿抽提法提取病毒悬液中的RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增N基因碳末端的核苷酸450个(bp)片段,对扩增产物进行序列测定和基因分型。用微量中和试验测定健康人群麻疹病人急性期血清中和麻疹疫苗株和野毒株的中和抗体水平。结果从82份咽拭子中分离出19株H1基因型麻疹病毒。麻疹疫苗免疫血清和有免疫史麻疹急性期病人血清对麻疹野毒株的中和抗体几何平均滴度(GMT)分别为26.36和26.90,明显低于疫苗株,GMT分别为49.30和56.18。结论陕西省近年麻疹流行是由H1基因型麻疹野病毒引起,不排除疫苗对目前流行株保护性不足的因素。

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%。从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。

应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用

Human recombinant interferon α2b can inhibit replication of many viruses and it is an important prophylactic drug for virus infection. In this study, interferon α2b was used to study the biological function on measles virus and rubella virus replication in human. For each virus, selected population was divided into two groups, including with and without interferon α2b treatment, then the attenuated viral vaccine was used to inoculate each group and the respiratory samples were collected at fixed intervals. A highly sensitive and accurate Real-time PCR method was used to detect the virus copy number in samples. The results showed that the virus copy number was much lower after interferon treatment and suggested that interferon α2b could inhibit the measles virus and rubella virus replication in human.

RT-PCR法检测尿液标本中麻疹病毒核蛋白(N)基因的临床应用及意义

目的探讨逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)直接从临床麻疹患者的尿液中检测麻疹病毒特异性核蛋白(Measles vi-rus nucleoprotein,MV-N)基因诊断价值。方法选取2010-2011年安徽省蚌埠市散发的15例临床确诊为麻疹的患者,采集尿液,提取RNA,用RT-PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白的515 bp核苷酸片段。同时采集同一患者血清,进行MV-IgM抗体检测,并比较两种方法的阳性率。结果尿液RT-PCR法检测MV-N基因,15例患者中有14例扩增出阳性产物,阳性率为93.3%,高于血清MV-IgM抗体检测的阳性率60.0%(χ2=9.60,P=0.002)。结论麻疹病人尿液标本的RT-PCR检测可用于麻疹病毒的早期快速辅助诊断,特别是对于出疹初期的患者。同时对血清MV-IgM抗体阴性的病例进行此法复检,可弥补漏检。

浙江地区2012年麻疹病毒流行株基因特征研究

目的探讨浙江地区2012年3～9月麻疹病毒(MV)的基因特征。方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测麻疹患者的咽拭子标本,对部分PCR扩增阳性的片段进行基因测序并绘制系统进化树进行同源性分析。结果 88例麻疹患者咽拭子标本中经RT-PCR检测阳性76例,阴性12例;随机选择13例阳性标本进行基因测序,结果显示均为H1a亚型;系统进化树分析结果表明,13株均为H1a基因亚型,与该型参考株AF045205、AF045206核苷酸同源性为98.0%～99.0%。结论 H1a基因型是浙江地区2012年MV流行的优势亚型,无输入性的其他亚型出现。

2014年北京市西城区40例麻疹患者分离的麻疹病毒基因型及同源性

目的：了解北京市某城区2014年分离的麻疹病毒基因型，及时发现输入性麻疹病例。方法采用荧光聚合酶链反应（PCR）方法，对北京市西城区2014年采集的标本进行病毒核酸鉴定、RT-PCR 扩增，扩增产物进行测序及序列比对分析。结果2014年北京市西城区共采集81例麻疹疑似患者的82份标本，其中咽拭子63份，尿19份。麻疹病毒核酸检测阳性70例，RT-PCR 扩增、测序获得基因序列40份，麻疹病毒培养阳性毒株37例。种系进化树分析显示，获得的40份麻疹病毒基因序列与 H 基因簇代表株 Chin9322／H1a，以及世界卫生组织推荐的代表株 MVi／Hunan．CHN／0．93／7／H1在同一分支上，核苷酸水平上同源性分别为98％～98．9％、96．9％～97．8％；氨基酸水平上同源性分别为97．3％～99．3％、95．3％～98％。结论2014年北京市西城区麻疹病例以本土基因型（H1）病例为主，进一步加强麻疹病例病原学监测对麻疹输入性病例的控制和预防具有重要意义。

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率。PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7。用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达。将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达。反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达。用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率。

荧光定量-聚合酶链反应法快速检测麻疹病毒核酸

目的:采用荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)法,检测麻疹病毒核酸,用以建立和推广一种敏感、特异、快速的麻疹检测新技术。方法:TaqMan特异性荧光标记探针法,进行特异性、敏感性和麻疹疑似患者临床标本的检测。结果:FQ-PCR法检测麻疹病毒核酸具有高度的特异性和敏感性,本次试验检测灵敏度达0.1 TCID50。在14份麻疹患者咽拭子标本中,有13份标本检出麻疹病毒核酸,从核酸提取至完成检测仅需3 h。结论:FQ-PCR法为麻疹病毒核酸检测提供了一种可靠的方法。

麻疹病毒属病毒非结构蛋白结构及功能研究进展

麻疹病毒属在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科,其成员包括麻疹病毒（Measles virus,MV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）、牛瘟病毒（Rinderpest virus,RPV）、海豹瘟病毒（Phocine distemper virus,PDV）和小反刍兽疫病毒（Peste-des-petits-ruminants virus,PPRV）。

深圳地区麻疹病毒核蛋白N基因序列分析

目的 探讨深圳市麻疹病毒的基因型别和特征。方法 采用B95a细胞分离培养麻疹病毒 ,通过RT -PCR方法扩增麻疹病毒核蛋白N基因C末端 4 5 0bp片段并测序 ,分析和基因库Genebank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性。结果 分离到 1株麻疹病毒 ,与H1基因型代表株相比同源性为 98 4 %。

麻疹病毒荧光定量RT-PCR反应体系的建立

目的:建立一种快速、敏感、特异性高的麻疹病毒核酸检测方法,以便对早期麻疹病毒感染做出准确及时的临床诊断。方法:采用TaqMan特异性荧光标记探针标记的RT-PCR技术对40例临床疑似麻疹患者的咽拭子进行麻疹病毒核酸的检测,同时对其血清用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测麻疹特异性抗体IgM。结果:40份患者咽拭子RT-PCR检测均阳性,40位患者入院第2天血清ELISA法检测,麻疹特异性抗体IgM阳性28例,阴性12例,1周后对12例麻疹特异性抗体IgM阴性的患者再次检测,结果12例全阳性。结论:荧光定量RT-PCR检测麻疹病毒方法有较好的敏感性和特异性,与血清麻疹特异性抗体IgM检测方法相比,荧光定量RT-PCR法在临床症状出现后就能检测到,同时不受标本量的限制,在短时间内就可完成检测,更适合作麻疹早期诊断的实验室检查依据。

麻疹病毒细胞受体研究进展

麻疹病毒是一种引起儿童急性呼吸道感染的传染病,属于副黏病毒科麻疹病毒属,同属的还包括犬瘟热病毒、牛瘟病毒等。细胞受体是病毒入侵易感细胞和启动感染的关键。目前,3种蛋白质分子——膜辅蛋白CD46、信号淋巴细胞激活因子SLAM和细胞黏附分子Nectin-4已经被证实是介导麻疹病毒入侵易感染细胞和启动感染的受体。论文综述了麻疹病毒3种细胞受体的研究进展,对深入了解病毒与宿主间的相互关系及有针对性地进行抗病毒药物、疫苗研制具有重大意义。

甲肝和麻疹病毒混合感染人胚肺二倍体细胞病毒增殖动态及与细胞相互作用的研究

目的 探讨甲肝病毒 (HAV)和麻疹病毒 (MV)混合感染人胚肺二倍体细胞 2BS株 (2BS)病毒增殖动态及病毒与细胞相互作用的关系 ,为制备甲肝 -麻疹二联活疫苗提供基础资料。方法 将HAV和MV先后感染2BS ,应用细胞病理学、亲和素 生物素系统免疫组化技术和电镜技术检测HAV和MV在 2BS内增殖动态及 2种病毒与细胞的相互关系 ,观察HAV和MV在细胞内的超微结构。结果 HAV和MV能在同一种细胞基质中增殖 ,也能在同一个细胞中增殖 ,但 2种病毒与细胞的相互作用明显不同。