黄素腺嘌呤二核苷酸在热石墨柱电极上电化学行为及吸附溶出分析

研究了黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在热石墨柱电极上的电化学行为。发现对吸附有FAD的电极加热同时进行循环伏安扫描,随电极温度升高,氧化还原峰电位负移,峰电流减小,峰形变差。采用方波伏安进行吸附溶出分析,如果只在吸附步骤对电极加热,室温溶出,则随电极温度升高,溶出峰电流显著增加。这主要归因于直接对电极加热引起的强制热对流,这种对流能提高传质,促进吸附,增强溶出响应。5min预富集对电极加热到72℃,检出限可以达到1×10-8mol/L(S/N=3),比室温27℃时降低了一个多数量级,相应灵敏度也明显提高。

17β-雌二醇-黄素腺嘌呤二核苷酸结合物的合成

根据ＡＲＩＳ的需要，设计出标题物的分子结构模型。以黄素－５′－单磷酸、６－酮－１７β－雌二醇羧甲基肟和Ｎ６－（６－氨基己基）腺苷－５′－单磷酸为原料，经过３步反应合成出标题物。采用酶激活试验和免疫抑制试验确证了标题物的结构。

黄素腺嘌呤二核苷酸通过激活SCAD抑制大鼠病理性心肌肥厚和心肌纤维化

目的探究黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在自发性高血压大鼠病理性心肌肥厚和心肌纤维化中的作用及防治机制。方法选取12周龄的自发性高血压大鼠(SHR)及周龄匹配的Wistar大鼠。经尾静脉注射FAD(每天1μmol/kg)治疗10周后,采用无创血压测量仪检测大鼠的血压及心率;超声心动图和组织学方法观察病理性心肌肥厚和心肌纤维化程度;Western blot方法检测短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)、CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的蛋白表达水平;免疫荧光单标法进一步验证SCAD的蛋白表达水平;荧光定量PCR检测SCAD、ANF、脑利钠肽(BNP)以及CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的mRNA表达水平;检测SCAD酶活性、ATP、游离脂肪酸、BNP及活性氧含量。结果自发性高血压大鼠经FAD治疗后,收缩压和心率均明显降低;病理性心肌肥厚和心肌纤维化程度得到明显改善;心肌组织中SCAD的mRNA、蛋白表达、酶活性及ATP含量均显著增高,游离脂肪酸和活性氧水平明显降低(P<0.05)。结论FAD可能通过激活SCAD,改善心肌能量代谢,减少氧化应激,从而抑制自发性高血压大鼠病理性心肌肥厚和心肌纤维化。

牛乳中黄嘌呤氧化酶研究综述

综述了牛乳中黄嘌呤氧化酶的各种性质及其应用。其性质主要包括:酶的构成、酶的分子量、酶的活性部位、酶的最适pH与最适温度、酶所催化的反应、反应类型、反应底物及产物等。另外,还介绍了一些酶反应动力学、酶活力的评价方法和酶的抑制剂等方面的问题。

亚油酸与核黄素或FAD激发态之间电荷转移的直接证据

根据荧光显微镜方法,我们首次发现核黄素(维生素B2)主要分布在细胞核的膜上和核的内部,故核黄素光敏化与辐射敏化的靶位置主要集中在细胞核内;当核黄素的浓度较大时,细胞膜上也有药物的分布,即在高浓度时,细胞膜也是光敏化与辐射敏化的作用位点之一.应用308nm激光光解时间分辨吸收方法,以亚油酸作为脂质的模型化合物,研究了亚油酸与核黄素和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的激发三重态之间的电荷转移过程,首次给出了电荷转移的直接证据.

黄素类光核酸酶对DNA定位损伤的直接检测

The interaction of oxidized FAD radical with dGMP, dAMP and single-stranded DNA (ssDNA) was investigated in neutral aqueous solution using time-resolved 248 nm laser flash photolysis aimed at elucidation of the initial photosensitization mechanism. The characterized absorption spectra of transient species were observed. Moreover, direct observation of stabilized DNA guanyl radical has provided transient evidence for site-selective photosensitized damage of DNA at guanine moiety, which has simulated the major initial species produced by the direct effect of ionizing radiation or UV light on DNA.

杂交犬单胺氧化酶B基因单核苷酸多态分布研究

单胺氧化酶B（monoamine oxidase B，MAOB）是降解单胺类神经递质的重要酶类，其活性与神经活动和行为有密切联系。MAOB在体内的活性受遗传因素SNP位点多态性影响。犬MAOB基因第3外显子上sNPT199C导致第67位氨基酸由半胱氨酸转变为精氨酸，影响MAOB的辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的结合（结合部位位于62～103个氨基酸之间），从而导致对单胺类物质氧化脱氨效率改变。

FAD核酸适配体生物传感器的制备及其葡萄糖检测的应用

以纳米金(gold nanoparticles,AuNPs)为主体,甲烷氧化菌素(methanobactin,Mb)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为配体构建FAD核酸适配体传感器。利用AuNPs颗粒较强的吸附能力,将Mb包裹于纳米颗粒上,形成稳定的Mb-AuNPs结构体。采用滴涂法将Mb-AuNPs结构体修饰于裸金电极表面,借助Mb结构中的—COOH与FAD牢固结合,将FAD引入Mb-AuNPs结构体上,提高对葡萄糖的识别能力,从而构建具备葡萄糖氧化酶活性的新型核酸适配体生物传感器。通过循环伏安法及时间-电流曲线法探讨其应用于葡萄糖检测的可行性。在温度25℃、pH 7.2时,葡萄糖浓度为10~200μmol/L,与该生物传感器的响应电流存在良好的线性关系,R^(2)为0.99791,检出限为4.22×10^(-8) mol/L(R_(SN)=3)。该核酸适配体传感器具有制备简单、价格低廉、易于操作、可快速检测等优点。

17β-雌二醇-ARIS构建及其标准曲线的质量评估

以 1 7β-雌二醇 -黄素腺嘌呤二核苷酸结合物为标记物 ,以葡萄糖氧化酶为全酶 ,建立了 1 7β-雌二醇脱辅基酶再激活免疫测定系统 (1 7β- E2 - ARIS) ,完成了两条标准曲线的制作 ,通过 logit代换法对两条标准曲线进行了直线回归。两条标准曲线的拟合度 (r)分别为0 .996 7* * 和 0 .9991 * * ,灵敏度分别为 1 1 .5 4pg· m L- 1 (2 . 31 pg·孔 - 1 )和 1 4.88pg·m L- 1 (2 . 98pg·孔 - 1 ) ,平均变异系数(CV% )分别为 4.6 4%和 9.34% ,测定范围为 31 .2 5～ 1 0 0 0 pg·m L- 1 。

植物乳杆菌LAI的酵母表面展示

为了研究亚油酸异构酶(LAI)的功能并构建基因工程菌株,克隆了植物乳杆菌lp15-2-1的lai基因并对其编码序列进行分析比对,随后将其融合酵母信号肽序列和α-凝集素锚定序列,构建酵母表面展示载体;使用电击法转化酿酒酵母K601,并在尿嘧啶缺失型培养基上筛选出转化子.氨基酸序列比对分析表明,LAI与肌球蛋白交叉反应抗原蛋白家族同源性极高,N端含有一个半保守的黄素腺嘌呤二核苷酸结合基序.对酵母工程菌株的研究表明,LAI成功地在酵母细胞表面展示,酶活在诱导培养48 h时达到最大,为40.5 U/mL.气相色谱检测发现,酵母工程菌株能够合成单一的c9t,11-共轭亚油酸异构体.

NADPH结构类似物对一氧化氮合成酶电子传递过程的影响

一氧化氮（NO）可作为信使和细胞因子参与血压调节、神经信息传递及抗感染防御等重要功能。生物体内NO主要由一氧化氮合成酶（NOS）以左旋精氨酸为底物，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），黄素单核苷酸（FMN），四氢生物蝶呤等因子辅助下生成。在NO合成过程中，电子由NADPH，经FAD、FMN功能域，传递到氧化酶域。

Renalase在CKD患者高血压发病机制中的作用

据美国和其他国家透析登记数据表明患心血管疾病的终末期肾病（ESRD）患者是非透析人群的6-10倍。许多研究表明ESRD患者有许多产生心血管疾病的高危因素如交感神经系统活性增强、氧化应激增加以及广泛的动脉钙化。研究表明交感神经系统（SNS）和肾脏有很强的联系，2005年JianchaoXu等研究发现肾脏分泌一种新的蛋白质，被称之为“renalase”。是依赖黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的单胺氧化酶，其可降解循环中的儿茶酚胺从而降低交感神经系统的活性，调节心血管的功能及外周血压。

乳糖诱导E.coli发酵生产FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶

黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH,EC1.1.5.9),具有辅基结合紧密、催化效率高的优点,可替代目前诊断用葡萄糖氧化酶应用于血糖指标的临床生化检测。本文选取Burkholderia cepacia的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)构建表达质粒pTrc99a-gdh,转化E. coli BL21(DE3)。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导发酵,通过酶活测定及聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,获得可溶性表达的FAD-GDH,分子量约为60000。利用乳糖替代IPTG作为诱导剂,摇瓶水平初步探索诱导条件,酶活达到994U/L。7.5L发酵罐放大培养该菌,采用梯度流加补料策略,分阶段温度控制,并采用不同的乳糖流加速率进行诱导。当采用0.3mL/min的乳糖流加速率时,酶活达22200U/L,菌体量达69.48g/L。经过镍柱层析,最终获得纯酶的比酶活104.5U/mg。为医用诊断原料用酶葡萄糖脱氢酶新酶种的工业化生产提供借鉴。

启动子串联及改造提高FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶在Bacillus subtilis中的表达

以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase with FAD,FAD-GDH,EC 1.1.99.10),与辅基结合紧密,催化效率高,是临床检测血糖指标的新型诊断用酶。将Burkholderia cepacia的FAD-GDH基因(gdh)构建含单启动P_(HpaⅡ)的穿梭质粒p MA5-1,在蛋白酶缺陷型菌株Bacillus subtilis WB600中表达。为了获得该酶的高效表达,采用启动子串联及改造策略考察产酶情况。将4种启动子(P_(amyQ’),P_(43),P_(gsiB),P_(opuaa))分别与质粒上自带的启动子P_(HpaⅡ)串联,结果表明P_(HpaⅡ)-P_(amyQ’)串联组合获得的FAD-GDH胞内酶活最高,为2 497 U/L,是串联前单启动子的2.7倍。为了减少发酵过程中,葡萄糖和甘油对产酶的抑制作用,在串联组合的基础上删去P_(amyQ’)启动子中与碳代谢调控蛋白结合的cre位点,使胞内产酶水平提高至3 626 U/L,说明cre位点的去除能够减少碳代谢产物对启动子转录的抑制。本研究为新型诊断用酶FAD-GDH的菌种改造和工业化生产应用提供参考与借鉴。

基于磁性纳米粒子的葡萄糖生物传感器

葡萄糖是生物体的重要代谢产物，其浓度的检测对糖尿病人极为重要。葡萄糖氧化酶因其价格低廉、稳定性好和实用性强而成为一种理想的酶。它含有素黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）氧化还原中心，能催化电子从葡萄糖转移至葡萄糖酸内酯，已经被广泛应用于监测糖尿病的葡萄糖水平。然而，由于黄素腺嘌呤二核苷酸深深地位于蛋白质的内部，即使葡萄糖氧化酶有活泼的性质，也不能轻易实现电子在酶与电极间的直接传递。

维生素B2缺乏与口腔疾病

众所周知,口角炎、口腔溃疡等所谓＂上火＂表现,其实常是因维生素缺乏特别是维生素B2缺乏所致。 维生素B2（核黄素）是构成体内重要含磷化合物——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的成分,FAD是细胞内一种参与重要代谢反应的氧化还原辅酶。它广泛参与体内各种氧化还原反应,可促进糖、脂肪和蛋白质的代谢。同时FAD作为一种维生素B2衍生物,对维持皮肤、黏膜和视觉的正常机能均有一定的作用。

大肠杆菌分泌表达重组人肝再生增强因子的纯化、鉴定与活性研究

目的建立一种大肠杆菌分泌表达型重组人肝再生增强因子(rhALR)的纯化工艺,并对产品进行鉴定和活性研究。方法通过沉淀、色谱等方法的条件优化,建立纯化工艺,通过电泳、HPLC、N-末端氨基酸测序、免疫杂交、同位素掺入、全波长扫描等方法对纯化产品进行鉴定和活性测定。结果建立了rhALR的纯化工艺路线,40%(NH4)2SO4沉淀,Butyl-S FF疏水色谱,CM-S FF离子交换色谱,Superdex-75分子筛色谱纯化,重组蛋白质的纯度大于95%。该蛋白质稳定存在的形式为二聚体,其单体的相对分子质量为15 000。该蛋白质结合辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),对损伤后的肝细胞具有明显的促进作用,明显优于以包涵体形式表达的rhALR。结论从大肠杆菌分泌表达体系能分离纯化得到高纯度、具有生物学功能和活性的rhALR,是潜在的临床治疗肝病药物。

SERS光谱研究银离子诱导葡萄糖氧化酶结构变化

重金属离子的毒性通常是指其与蛋白质(尤其是各种不同的具有生物催化活性的酶)或核酸的相互作用。本研究利用表面增强拉曼(SERS)光谱技术探讨银离子与葡萄糖氧化酶(GOX)的相互作用。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是GOX中对其SERS信号产生贡献的部分,通过对比Ag+-GOX和Ag+-FAD混合物的SERS光谱,证实了Ag+是与GOX中的辅酶因子FAD发生了相互作用。进而通过比较GOX与Ag+-GOX的SERS光谱图,推断出Ag+在FAD中N-5和C-4上的羰基氧之间形成了配位键,这项研究为分析重金属离子与蛋白质的相互作用提供了可靠的依据,具有非常重要的生命科学意义。

人类隐花色素蛋白(Homosapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与FAD结合状态的NMR研究

隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到全长1 761bp的HsCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA-HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和PCR检测获得重组质粒BacmidHsCRY1,转染昆虫Spodoptera frugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS-PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100mmol/L及200mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.31P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒-昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.