黄色短杆菌中L-异亮氨酸同位素丰度及分布的分析方法研究

随着代谢组学、蛋白质组学等生命科学领域的迅猛发展,稳定同位素标记试剂,尤其是标记氨基酸,因无放射性、与非标记化合物理化性质一致等优势得到广泛应用。该文建立了一种稳健、快速的氨基酸同位素丰度分析方法。方法采用Hypersil Gold Vanquish(100 mm×2.1 mm,1.9µm)色谱柱,以水和含0.1%甲酸的甲醇为流动相,正离子模式下进行液相色谱-高分辨质谱联用(LC-HRMS)分析;测得细菌发酵液中L异亮氨酸-15N的同位素丰度为98.58%,相对标准偏差为0.03%,可应用于不同稳定同位素(15N或^(13)C)示踪的黄色短杆菌中L-异亮氨酸同位素丰度及分布的准确测定。该方法具有简便、灵敏、稳健等优点,有望在合成生物学、同位素示踪代谢流等研究中发挥重要作用。

营养及环境条件对黄色短杆菌WL-10发酵生产L-异亮氨酸的影响

研究了能积累 L 异亮氨酸的黄色短杆菌WL 10的菌体生长规律 ,并讨论了葡萄糖、玉米浆以及磷酸盐等几个主要的营养物质对其积累L 异亮氨酸的影响 ,确定了较优的发酵条件为 :葡萄糖 12 % ,(NH4) 2 SO42 % ,玉米浆 2 % ,KH2 PO40 1% ,MgSO40 0 5 % ,CaCO33% ,种龄 9h ,接种量为 6 %。在此条件下 72h摇瓶产酸可达 2 3%左右。在上述基础上 ,研究了不同温度对WL 10积累L 异亮氨酸的影响 ,提出了分阶段变温控制的操作模式 ,即 0～2 5h ,培养温度为 31℃ ,2 5h后将温度降为 2 8℃ ,采用 5L罐实验 6 0h可积累L 异亮氨酸2 5 %。

一种新微胶囊固定化黄色短杆菌产谷氨酸研究

针对微生物发酵生产谷氨酸过程中存在的问题,提出了一种固定化微生物发酵生产谷氨酸的新方法.采用硫酸纤维素钠(NaCS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDMDAAC)构成:NaCS-PDMDAAC微胶囊,由此微胶囊固定化黄色短杆菌后发酵生产谷氨酸.考察了不同质量浓度葡萄糖对游离和微囊化黄色短杆菌产谷氨酸的影响,并利用微胶囊化的黄色短杆菌进行多批次半连续培养.结果表明,NaCS-PDMDAAC微胶囊与产谷氨酸的黄色短杆菌有很好的生物相容性,与游离培养相比较,微囊化后的黄色短杆菌的生长和产酸功能基本不受影响,容易获得较高的菌体密度,生产效率大大提高,胶囊平均生产能力可达到了15.29 g/(L·h).

大肠杆菌pheA基因在黄色短杆菌中的克隆与表达

在大肠杆菌中，影响苯丙氨酸生物合成的关键酶基因之一是ｐｈｅＡ基因。利用大肠杆菌棒状杆菌穿梭表达载体ｐＬＣＸ３６克隆了一个对反馈抑制不敏感的大肠杆菌基因ｐｈｅＡ，组建成质粒ｐＬＣＸ３７。ｐＬＣＸ３７以接合转移方法转移到抗氟代苯丙氨酸的黄色短杆菌３６２１等菌株中，获得若干基因工程菌株。经发酵测定，编号为３６２１０９的黄色短杆菌的苯丙氨酸产量比出发菌３６２１高出１倍。最高达２６２６ｍｇ／ｍｌ。

生物素及膜偶联间歇透析发酵对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

生物素作为微生物的生长因子,对生长速率、细胞膜通透性、代谢产物的生成等方面具有重要作用。为提高黄色短杆菌产L-亮氨酸产量,降低副产物生成,在30 L发酵罐水平研究了在培养基中添加20、50、80、120μg/L四种不同质量浓度生物素,对黄色短杆菌产L-亮氨酸的影响。结果表明:培养基中添加50μg/L生物素,黄色短杆菌发酵44 h,L-亮氨酸的产量最高,达到60 g/L,糖酸转化率为22%,副产物L-丙氨酸的质量浓度为8 g/L。在最适生物素浓度下,发酵36 h后,采用膜偶联间歇透析发酵工艺,发酵周期延长至56 h,L-亮氨酸的糖酸转化率为25%,较普通发酵工艺约提高13. 6%,副产物L-丙氨酸的浓度降低约71. 3%,L-亮氨酸的总产量提高了16. 7%。研究结果对提高糖利用率、降低副产物、提高生产效率等方面具有重要意义。

NH_4^+浓度对黄色短杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸的影响

以L-缬氨酸(L-Val)生产菌黄色短杆菌XV0505为供试菌株,以(NH4)2SO4为唯一添加N源,考察不同NH 4+浓度对发酵过程中菌体干质量、L-Val产量和葡萄糖消耗速率以及菌体内代谢流量的影响。研究表明:NH 4+浓度过高或不足都会影响发酵水平,降低L-Val的产量。合适的初始NH4+浓度为225 mmol/L,产酸期NH4+维持浓度为35 mmol/L时,有利菌体产酸。在此NH4+浓度下,在30 L发酵罐发酵60 h,发酵液中菌体生物量和L-Val质量浓度分别可达22.35和59.12 g/L。

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L-缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C.glutamicumATCC13032中克隆出L-缬氨酸合成途径上的限速酶——乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌-黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B.flavumATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L罐发酵实验结果显示:在野生型菌株发酵液中检测不到L-缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L-缬氨酸积累达5.0g/L。

黄色短杆菌氟基丙酮酸敏感型突变株的诱变选育

以黄色短杆菌 (Br.FlavumC - 12 )为出发菌株 ,亚硝基胍 (NTG)为诱变剂 ,通过诱变选育 ,筛选出氟基丙酮酸 (FP)敏感的菌株 ,以希望达到降低L

黄色短杆菌变异株AN78的发酵生产L-精氨酸的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AG77(AHV^r,TA^r,SG^r)为诱变出发菌株,经亚硝基胍(NTG)诱变处理和选育,获得一株能够积累大量L-精氨酸的菌株AN78(AHV^r,TA^r,SG^r,His^-)。AN78菌株在20L发酵罐中,以葡萄糖为碳源,以玉米浆、硫酸铵等为氮源的培养基中培养4d,产酸率可达61.1g/L,对糖转化率20.2％,与AG77菌株相比较,分别提高了95％和39.3％。发酵液中L-精氨酸的提取收率为71％。

黄色短杆菌TK0303的L-亮氨酸生物合成途径分析

应用途径分析方法分析了在拟稳态时黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)TK0303由葡萄糖发酵生产L-亮氨酸的代谢途径,确定了L-亮氨酸合成的最佳途径和最大理论产率。通过比较途径分析所获得的反应模型,确定了丙酮酸和乙酰辅酶A是L-亮氨酸合成途径的关键节点。在此基础上改变外界环境因子,强化L-亮氨酸生物合成途径中丙酮酸和乙酰辅酶A两个关键节点的代谢流,以期进一步提高L-亮氨酸产率。结果表明,经过谷氨酸以及醋酸铵的调节,代谢途径流量发生显著变化,L-亮氨酸产量有明显提高。

葡萄糖流加方式对黄色短杆菌生产L-亮氨酸的影响

利用30 L发酵罐,研究了黄色短杆菌TK0303生产L-亮氨酸的发酵工艺。考察了初始葡萄糖浓度和发酵过程中3种补料策略(分批间歇流加补料、恒葡萄糖浓度流加补料和DO-在线识别流加补料)对菌体生物量、L-亮氨酸产量、副产物含量及糖酸转化率的影响。最终确定:分批补料发酵的初始葡萄糖浓度为60 g/L,葡萄糖补加采用DO-在线识别流加方式。根据溶氧响应信号的特征反馈控制葡萄糖的流加速率,可实现葡萄糖的限制培养,有效减少了发酵副产物的含量,菌体生物量和L-亮氨酸产量得到显著提高,分别为21.8 g/L和41.3 g/L,且糖酸转化率高达22.4%。

基于代谢流量分析的黄色短杆菌TK0303合成L-亮氨酸发酵过程的优化

测定并计算了在发酵中后期L-亮氨酸等代谢物的胞外浓度和积累(或消耗)的速率。应用代谢流分析方法,通过MATLAB软件线性规划得到发酵中后期胞内代谢流分布及L-亮氨酸合成的理想代谢流分布。结果表明,在L-亮氨酸分批发酵过程中,有98.73%的葡萄糖进入糖酵解途径,仅1.27%进入HMP途径,55.10%的碳架进入TCA循环,25.21%用于合成L-亮氨酸。实验测定的合成L-亮氨酸的代谢流远低于理想代谢流(66.67)。根据代谢流分析结论,文中通过优化发酵过程控制如流加方式、溶氧水平等方面来减少副产物的生成,控制TCA循环代谢流,从而提高L-亮氨酸的产率。实验采用脉冲补料方式,控制溶氧浓度在20%左右,L-亮氨酸最高产酸达到38g/L。

贯叶连翘总提取物对黄色短杆菌的抗菌作用

报道了贯叶连翘总提取物作用于黄色短杆菌并经光照和未光照处理后对该菌的抗菌作用,目的是探讨贯叶连翘总提取物在光照和非光照处理时抗菌作用的异同。采用光密度(OD)值、活菌数(CFU)、最低杀菌浓度(MBC)值检测方法,测定了在12h的培养过程中,提取物作用时黄色短杆菌的OD640nm值、CFU、MBC值。结果表明提取物对该菌有很强的抑菌和杀菌作用,且这两种作用与其浓度有关,不需光照。

产L-亮氨酸营养缺陷型突变株黄色短杆菌SFL8-3的选育

氨基酸是构成蛋白质的基本单位,是生物体内不可缺少的营养成分,L-亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一,也是三种支链氨基酸之一,在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有重要的用途。以一株黄色短杆菌为出发菌株,经紫外线、盐酸羟胺和硫酸二乙酯等多次诱变处理,单菌落分离、摇瓶初筛和摇瓶复筛,获得了一株蛋氨酸和异亮氨酸双重缺陷型突变株SFL8-3(M et-,Ile-),摇瓶发酵L-亮氨酸产量达18.98g/L。

固定化产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3反应动力学的研究

The kinetics of immobilized cells of \%Brevibacterium ammoniagenes MA\|2\% and \%Brevibacterium flavum MA\|3\% cells were studied. By means of both a theoretical analysis of diffusion in the gel particles and an experimental determination of apparent kinetic parameters, the intrinsic kinetic parameters of immobilized cells of \%B.ammoniagenes MA\|2\% and \%B.flavum MA\|3\% cells were obtained.

产生L-异亮氨酸的黄色短杆菌的代谢途径分析

目的:代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布,其目标就是修饰初级代谢,将碳架物质流导入目的产物的载流途径,以获得产物的最大转化率。方法:利用途径分析方法对黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的途径进行了分析。结果:建立了9种基础模型,确定L-异亮氨酸理论最高摩尔产率是1;确定了黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的最佳途径的通量分布,并以此为依据进行发酵溶氧控制优化,溶氧分阶段控制发酵生产L-异亮氨酸比溶氧恒定控制方式发酵的产率提高了8.2%。结论:根据途径分析结果,通过改变发酵过程有关参数,可使目的产物产率得到提高。

黄色短杆菌产L-组氨酸菌株的诱变育种

以黄色短杆菌为出发菌,采用诱变育种的方法选育得到一株能高产L-组氨酸的突变菌株。在加有150g·L-1葡萄 糖;35g·L-1硫酸铵;10g·L-1蛋白胨的发酵培养基中培养72h,产L-组氨酸128.28mg·L-1。

L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌的选育

以黄色短杆菌BF420为出发菌株,经过紫外线和亚硝基胍(NTG)复合诱变处理后,获得一株甲硫氨酸缺陷(Met-)及抗α-氨基丁酸(α-AB)的L-异亮氨酸产生菌BM2610,该菌株在未进行优化的发酵条件下能够积累L-异亮氨酸的量为7.12g.L-1,比出发菌株BF420提高了122.5%。

絮凝方法收集产氨短杆菌MA-2、黄色短杆菌MA-3条件的优化

采用壳聚糖作絮凝剂收集富含延胡索酸酶活力的产氨短杆菌MA 2、黄色短杆菌MA 3。研究了絮凝剂加入量及加入时混合方式与时间等因素对延胡索酸酶活力及分离效果的影响 ,并对壳聚糖絮凝收集产氨短杆菌MA 2、黄色短杆菌MA

纤维素硫酸钠的批量制备及其NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化黄色短杆菌培养过程研究

在非均相反应制备纤维素硫酸钠方法的基础上,通过增加液固比,引入搅拌,使体系的温度分布和浓度分布都得到很大改进,由此可以保证产品质量的均一性。用正交试验进行了500 mL反应器制备条件的摸索,并将其逐步放大到1 L、5 L反应器中进行,确立了5 L规模的生产工艺条件。通过对不同规模下制得的硫酸纤维素钠产品在理化性质、制备微胶囊及在微囊化培养等方面对比较,表明研制过程有利于合成出高质量的硫酸纤维素钠,用于制备微胶囊。用NaCS-PDMDAAC(聚二甲基二烯丙基氯化铵—硫酸纤维素钠)微胶囊固定化黄色短杆菌,考察了葡萄糖浓度、摇床转速对黄色短杆菌生长和代谢谷氨酸的影响,确定了一个较优培养条件。胶囊平均生产能力达15.29 g /(Lh)(对微胶囊)。微胶囊固定化黄色短杆菌连续培养12批后,仍具有良好的代谢谷氨酸性能。