蜥蜴源黏质沙雷氏菌的分离鉴定与药敏试验

为弄清西北农林科技大学博览园1只观赏蜥蜴突发全身皮肤化脓溃烂、尾巴坏死脱落的病原,采集患病蜥蜴的坏死病灶及血液病料进行细菌分离纯化、生理生化试验、动物致病性试验、16S rRNA基因测序鉴定。结果显示,从病料中分离并纯化出1株菌株,该分离菌株的生理生化特性与黏质沙雷氏菌相符,且该菌对实验小鼠有致病性,其16S rRNA基因序列与NCBI中黏质沙雷氏菌的参考序列同源性为98%。结果表明,所分离到的菌株为黏质沙雷氏菌。药敏试验结果显示,分离菌株对诺氟沙星、丁胺卡那、头孢曲松、氧氟沙星、头孢噻肟等5种抗菌药物高度敏感,对复方新诺明中度敏感,对环丙沙星、头孢噻吩、庆大霉素、头孢氨苄、苯唑西林、多黏菌素B、林可霉素、四环素、氨苄西林等9种抗菌药物耐药。研究结果为筛选有效治疗药物提供了参考依据。

亚洲玉米螟越冬后幼虫致病细菌——黏质沙雷氏菌的分离鉴定及杀虫活性评价

本研究从新疆伊犁河谷新源县春播玉米田越冬后自然罹病亚洲玉米螟幼虫上分离获得1株细菌菌株ACB3014,通过形态学观察、生理生化特性及16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定,并采用饲喂法测定了该菌株对亚洲玉米螟3龄幼虫的致病性。结果表明菌株ACB3014为黏质沙雷氏菌Serratia marcescens。菌株ACB3014对亚洲玉米螟3龄幼虫的累积校正死亡率随菌悬液浓度的升高而增加。饲喂ACB3014菌悬液后第7 d,在浓度2×10^(4)~2×10^(8)cfu/mL下,亚洲玉米螟3龄幼虫的累积校正死亡率为27.78%~77.78%。接种第13 d,亚洲玉米螟3龄幼虫LC_(50)为3.79×10^(3)cfu/mL,当浓度达2×10^(8)cfu/mL时,LT_(50)为3.93 d。且染病后的亚洲玉米螟体色为暗红色和黑色,虫体呈脓状溃烂,散发出强烈异味。综上,黏质沙雷氏菌ACB3014菌株对亚洲玉米螟幼虫有很好的杀虫活性,具有很高的防治潜力,可用作亚洲玉米螟的绿色生物防治资源。

耐盐好氧反硝化菌黏质沙雷氏菌HL4的分离鉴定及脱氮性能

【目的】分离鉴定一株耐盐好氧反硝化细菌,以开发高效脱氮菌种,加强海水及咸淡水养殖尾水脱氮技术研究。【方法】采集花鲈(Lateolabrax maculatus)池塘原位底泥,采用稀释涂布法初步分离一株脱氮功能最佳的菌株HL4,通过16s rDNA测序以及生理生化实验鉴定菌株,通过设置不同碳源、碳氮质量比(m_(C)/m_(N))、pH、温度、盐度等条件探明其最适培养条件及脱氮性能。通过攻毒试验[以健康斑马鱼(Danio rerio)为受试生物],检验菌株的环境安全性。【结果】经鉴定,菌株HL4为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens),命名为S.marcescens HL4。以葡萄糖或琥珀酸钠为碳源,菌株HL4在m_(C)/m_(N)=20、pH=6.0~7.0、温度30℃的条件下具有较强脱氮能力,48 h TN去除率为81.83%~87.17%;该菌株在0~30的盐度环境下均可生长,在0~10盐度范围内72 h的总氮(TN)去除率为68.76%~76.59%,在20~30盐度范围内72 h的TN去除率为23.84%~53.94%;在NH_(4)^(+)-N质量浓度为0~100 mg·L^(-1)时,72 h NH_(4)^(+)-N去除率皆在90%以上,在NH_(4)^(+)-N质量浓度为500 mg·L^(-1)时,72 h NH_(4)^(+)-N去除率高达73.52%。健康斑马鱼在含1×10^(6)CFU·mL^(-1)菌株HL4的水体中15 d后,成活率100%。【结论】菌株HL4生物及环境安全性较高,在处理中高浓度铵废水以及治理咸淡水、低盐度海水养殖尾水等领域具有潜在的应用价值。

黏质沙雷氏菌次生代谢物对TMV的抑制机理

【目的】分离、纯化和鉴定黏质沙雷氏菌2A2次生代谢物中具有抑制TMV侵染力的活性成分,明确其对TMV的抑制机理。【方法】通过病毒生物学测定,确定黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV的抑制效率。为明确黏质沙雷氏菌2A2发酵液次生代谢物中抑制TMV侵染力的活性成分,通过TLC和硅胶柱层析对其发酵液进行了分离纯化,获得主要的次生代谢物,通过局部枯斑法测定各代谢物的生物学活性,筛选可显著抑制TMV侵染活性的物质,经NMR分析,确定其成分结构,进而确定物质组分。为进一步揭示代谢物对TMV的抑制机理,利用透射电子显微镜探索代谢物对TMV粒体形态的影响,TMV粒体与代谢物甲醇溶液混合30 min后,于透射电子显微镜下观察TMV粒体形态。同时,用代谢物甲醇溶液喷施处理寄主下部3片叶,共设5个处理:处理Ⅰ,喷施代谢物24 h后,接种TMV;处理Ⅱ,代谢物与等体积TMV汁液混合30 min后,接种叶片;处理Ⅲ,先接种TMV,24 h后喷施代谢物;处理Ⅳ,宁南霉素(50μL·mL-1)与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做阳性对照;处理Ⅴ,无菌水与等体积TMV汁液混合30 min后,接种下部叶3片做空白对照。分别在次生代谢物诱导和TMV侵染后1、3、5、7、9 d,取未经任何处理的上部叶,TRIZOL法快速提取总RNA并反转录cDNA,利用real-time RT-PCR分析样品PR基因和TMV的RNA相对表达量,进而明确代谢物处理寄主对寄主PR基因表达的影响和对TMV在寄主体内复制增殖的抑制作用。【结果】黏质沙雷氏菌2A2菌株对TMV具有显著的抑制作用。对其发酵液进行分离纯化,获得3种主要代谢物,通过局部枯斑法测定,编号为BJH-2的代谢物可显著抑制TMV的侵染活性,经NMR分析,确定了该代谢物为灵菌红素(prodigiosin)。透射电子显微镜结果显示灵菌红素可显著破坏TMV粒体,使TMV典型的杆状病毒粒体降解断裂成排列紊乱的短杆状。real-time RT-PCR结果表明,灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ可诱导寄主体内PR基因表达随着时间逐渐上调,第7天左右,三者处理的寄主体内PR1、PR2、PR4、PR5表达上调至高峰,显著高于空白对照,亦高于处理Ⅳ的阳性对照,从而提高系统抗性;灵菌红素处理植株后,处理Ⅰ、处理Ⅱ、处理Ⅲ寄主体内TMV RNA的表达量随着时间上调减缓,在接种TMV后的第9天,三者处理的寄主体内的TMV RNA含量分别是空白对照的11.98%、5.23%、15.90%,显著低于空白对照,亦低于处理Ⅳ的阳性对照。【结论】灵菌红素既对TMV在寄主体内的复制增殖具有抑制作用,又可诱导寄主产生系统抗性,整体效果高于宁南霉素,可作为防治植物病毒新的生物制剂。

黏质沙雷氏菌L15-2几丁质酶的分离纯化与性质研究

几丁质酶高产菌株黏质沙雷氏菌L15-2在含有1％胶体几丁质、0．3％K2HPO4、0．3％KH2PO4、0．05％MgSO4、0．05％CaCl2、0．001％FeSO4的产酶培养基中37℃培养4d后，粗酶液经过DEAE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100，电泳检测得到电泳纯的几丁质酶。该酶的性质特征测定结果表明，该几丁质酶的分子量为41．314 kD；最适作用温度为50℃，最适作用pH为6．6；在60℃之前热稳定性较好，在pH4～10范围内较稳定；各种金属离子对酶活力影响不同，Fe^2＋、Zn^2＋抑制作用明显．而Ba^2＋、Mn^2＋、Ca^2＋对酶活性有一定的促进作用。几丁质酶对致病真菌的抑制作用也很明显。

内生黏质沙雷氏菌LIEH 92对向日葵菌核病的防治效果及其防病机制研究

本研究评价了从向日葵列当体内分离筛选得到的内生黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LIEH 92对向日葵菌核病进行盆栽与大田防效评价,并测定了该菌株的生理特性和其在根际土与向日葵体内的定殖情况。结果表明,LIEH 92发酵液对向日葵菌核病的室内盆栽防效达73.35%,对大田根腐型菌核病和盘腐型菌核病防效分别达53.48%和38.64%。菌株LIEH 92可产生几丁质酶,并能在根际土和向日葵根、茎、叶内定殖与传导,定殖菌量达102~106 cfu/g。其在向日葵植株的根内定殖数量最大,茎中次之,叶中最少。在灭菌土中LIEH 92在根际土和向日葵根部的定殖菌量小于在自然土中其在相应部位的定殖菌量,而灭菌土中LIEH 92在向日葵茎部和叶部的定殖菌量则大于自然土中相应的定殖菌量。LIEH 92处理可提高向日葵植株PAL、POD和PPO等防御酶活性,从而诱导向日葵对菌核病的抗性。LIEH 92对向日葵菌核病具有生防潜力。

家养观赏地图鱼肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌与黏质沙雷氏菌的分离鉴定及耐药性分析

本试验旨在通过细菌分离鉴定,明确家养观赏地图鱼的死因,筛选敏感药物。采用常规方法分离纯化细菌后,进行细菌形态学观察,并通过小白鼠致病性试验、细菌主要生化鉴定、16SrDNA序列测定分析、药敏试验及耐药基因检测等方法对分离的细菌进行鉴定及耐药分析。分离出3株革兰氏阴性短杆菌,根据细菌形态特征及理化特性,结合16SrDNA序列测定与系统发育分析结果,判定其分别为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens),其中肺炎克雷伯氏菌具有较强致病性。3株细菌均对洛美沙星、氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素敏感,对阿莫西林、氟苯尼考、克林霉素、甲硝唑等具有较强耐药性。结果表明,肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌、黏质沙雷氏菌的混合感染是家养观赏地图鱼的死亡原因。

黏质沙雷氏菌3种几丁质酶基因的克隆及功能预测

黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)可产生多种几丁质酶,为比较黏质沙雷氏菌Txch-1中几丁质酶系在结构上的差别,利用3对特异性引物从Txch-1中扩增获得了3种几丁质酶SeChiA、SeChiC、SeChi40基因,并进行生物信息学分析与比较。结果表明:SeChiA基因全长2 196 bp,含有1个1 692 bp的开放阅读框,编码563个氨基酸。SeChiA与Sanguibacter sp.C4几丁质酶(ABB91448)及多种沙雷氏菌属的几丁质酶A高度同源(≥94.8%),与多种昆虫几丁质酶也表现出较高的同源性(≥68.74%);结构域分析发现SeChiA含有分泌信号肽、N端结构域和催化域。SeChiC基因全长1 623 bp,含有1个1 443 bp的开放阅读框,编码480个氨基酸;SeChiC与S.marcescens不同菌株产生的几丁质酶C都表现出较高的同源性(≥95%);结构域分析发现SeChiC含有催化域、黏蛋白Ⅲ同源区及几丁质结合域。SeChi40基因全长1 501 bp,含有1个1 083 bp的开放阅读框,编码360个氨基酸;结构域分析发现它只含有催化域,而不含分泌信号肽和几丁质结合域。氨基酸序列比对发现SeChi40与其他几丁质酶的同源性较低(≤37.78%),可能是个新基因。

响应面试验优化黏质沙雷氏菌利用菜籽饼粕产灵菌红素工艺

为筛选得到一株产灵菌红素的黏质沙雷氏菌为发酵菌种,采用响应面法优化培养基组分和发酵条件,提高黏质沙雷氏菌生产灵菌红素的效率,结果表明,黏质沙雷氏菌最优培养基组分及发酵条件为玉米粉用量10 g/L、菜籽饼粕用量21.7 g/L、硫酸锌质量浓度0.05 g/L、发酵液初始pH 5.8、接种量5.5%、装液量80 m L/250 m L三角瓶、温度27℃、摇床转速200 r/min,培养24 h后,发酵液中灵菌红素产量达到11.56 g/L。本研究为高温菜籽饼粕原料发酵生产灵菌红素提供理论依据。

MALDI-TOF MS对草莓中铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌的检测

为了评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)在草莓微生物风险监测的应用价值,确定草莓的危害识别微生物及其特征,采用选择性培养方法对50份草莓样品中铜绿假单胞菌和黏质沙雷氏菌进行分离,MALDI-TOF MS对分离微生物进行鉴定,应用SARAMIS Premium软件对这2种食物感梁性病原微生物的蛋白质图谱进行分析和加权修正。结果表明,铜绿假单胞菌在草莓中的检出率为18%,黏质沙雷氏菌检出率为20%,实验获得草莓中分离铜绿假单胞菌完全拟合特征峰12组,标识峰聚类分析结果表明,分离铜绿假单胞菌差异较大;获得草莓分离黏质沙雷氏菌完全拟合特征峰有8组,标识峰加权聚类分析结果可认定分离的2株黏质沙雷氏菌同源。MALDI-TOF MS方法可标识草莓分离微生物的蛋白质特异性特征,且对微生物的溯源及特异性分析有一定优势,表明其在农产品复杂微生物环境中具有应用潜力。

拉萨地区牦牛源黏质沙雷氏菌的分离鉴定及药敏检测

为研究拉萨地区牦牛乳中黏质沙雷氏菌的分离鉴定及耐药性情况,试验采用16S rDNA引物对分离株进行PCR鉴定及革兰氏染色和生化鉴定,采用包括头孢菌素类、大环内酯类在内的25种常用抗菌药物进行药敏试验,并人工感染小鼠检测分离菌株的致病性。结果表明:分离菌株在培养基上培养呈现白色,而标准菌株呈现红色;革兰氏染色和生化鉴定结果与黏质沙雷氏菌的标准菌株相同;PCR鉴定结果为黏质沙雷氏菌;对头孢哌酮、环丙沙星等8种抗菌药物敏感,对头孢拉定、万古霉素等15种抗菌药物具有一定的耐药性;致病性不强。说明分离菌株已对多种抗菌药物耐药,这不仅反映了越来越多的公共卫生问题,也为牦牛的疫病防控敲响警钟。

铜绿假单胞菌TBPY与黏质沙雷氏菌SMA协同降解三溴苯酚的特性

三溴苯酚是一类难降解、对环境危害大的物质。在本课题组前期的研究基础上,本研究以自有的铜绿假单胞菌株(Pseudomonas aeruginosa,TBPY)和黏质沙雷氏菌株(Serratia marcescens AB 90027,SMA)为出发菌种,研究两菌降解TBP的协同性,同时考察相关因素对该协同降解的影响。研究结果表明,这两种微生物具有良好的协同性,两菌协同降解TBP的效果明显优于单菌。在初始pH值为6.5,接入稳定期的TBPY,TBP先经TBPY降解两天后再接入稳定期的SMA,两菌接种量比为2:1时,TBP降解效果最好,100mg/L的TBP5天内降解率可达到97%。本研究不仅为三溴苯酚的微生物降解提供了一个新的有效途径,也为卤代芳香化合物,乃至环境污染的生物降解提供一种新的思路。

黏质沙雷氏菌产几丁质酶的发酵工艺优化

利用均匀设计法,优化一株黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)产几丁质酶培养基的组分;同时,利用正交设计法优化其摇瓶发酵产酶的条件.研究结果表明,最佳培养基组分(质量分数):0.504%胶体几丁质,1.178%酵母粉,0.025%MgSO4.7H2O,0.095%K2HPO4,0.001%FeSO4.7H2O,0.005%山梨醇,0.030%KH2PO4;最佳摇瓶发酵工艺条件:培养时间为48 h,发酵温度为30℃,初始pH值为9.0,装液量为30 mL,接种量为1%.在此优化条件下,酶活力可达9.39μkat.L-1,比未优化的产酶条件下酶活力提高了81.6%.

黏质沙雷氏菌诱导的黄喉拟水龟SMART cDNA文库构建及相关基因的鉴定

以致病黏质沙雷氏菌人工感染的黄喉拟水龟肝组织为材料,应用SMART(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)技术,构建了黄喉拟水龟的全长cDNA文库。首先用SMARTTM PCR cDNA systhesis kit合成全长的双链cDNA,通过琼脂糖凝胶分级分离技术切除小片段的cDNA,将大于500 bp的cDNA连接到pGEM-T载体中,电转化到J M109感受态细胞。在构建好的文库中,经测定,文库约含有1.8×105个重组子,重组效率达90%,插入片段多在0.5～3.0 kb之间。对库中长度约为1 000 bp的80个基因进行了测序,结果显示大部分首次在龟类发现。测序鉴定的基因包括免疫相关基因9个、信号传导基因6个、催化酶类基因8个、糖代谢相关基因2个、转运相关基因1个、结构基因2个。

基于易错PCR技术的黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA的定向进化

利用易错PCR技术对黏质沙雷氏菌脂肪酶基因LipA进行定向进化,经过筛选最终获得一个比活力比野生酶提高了425 U/mg的突变体ep1,测序分析ep1有5个氨基酸发生了突变,与野生酶相比ep1的最适pH值由原来的8.5降低为7.5,Tm值提高3℃,Km值由原来的40 mg/mL降低为12.5 mg/mL。对其三维结构进行分析,推测酶学性质的改变可能与处在活性中心右前方双螺旋发卡结构上的I58A、和处在下部β卷曲折叠拐角处的S375G的突变有关。

一株耐高温抑菌黏质沙雷氏菌的鉴定及其红色素的初步分离

[目的]为了了解黏质沙雷氏菌的抑菌机理及温度对其产生色素的影响。[方法]从土壤中分离纯化得到1株产红色素细菌,对该菌进行生理生化和16S rDNA鉴定,同时对该菌产生的红色素进行了初步的探讨。[结果]该菌为黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens),在28℃条件下培养红色素产量最高,37℃下仍能产生色素,说明该菌株是耐高温红色素产生菌。紫外全波长扫描分析和薄板层析结果表明,其红色色素有可能是灵菌红素。[结论]该菌对霉状杆菌和镰刀菌等病原菌具有一定的抑制作用。

黏质沙雷氏菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因,大小为1 692 bp,推测其编码一条长563个氨基酸的多肽链,分子量约为60 900。同源分析研究结果表明从C8-8中克隆的chiA基因序列与黏质沙雷氏菌株141(DQ 990373.1)和14041菌株(DQ 493896.1)的chiA基因序列相似性最高,达到99%。结构域分析结果表明从C8-8中克隆的chiA基因N末端(23 AA)存在典型的信号肽序列,C端存在另外两个结构域,即PKD区(73 AA)和几丁质酶催化区(387 AA)。采用大肠杆菌表达系统重组表达chiA基因,结果表明重组菌株在几丁质诱导培养基上能产生透明的水解圈。采用SDS-PAGE电泳分析,结果表明chiA重组表达产物的相对分子质量约为60 000,与预测分子量大小基本一致。初步提纯后,生物活性试验结果表明该重组表达产物能水解几丁质,在几丁质培养基上产生透明的水解圈。

黏质沙雷氏菌产几丁质酶二步发酵工艺的优化

采用二步发酵法,研究黏质沙雷氏菌的产几丁质酶发酵条件.在二步发酵产酶的过程中,通过单因素法优化得到二步发酵培养基中最适碳源、氮源的质量分数和菌龄,同时选取发酵时间、初始pH值、接种菌体量和装液量4个因子进行正交试验.最终得到的最优条件:胶体几丁质质量分数为0.8%,酵母粉质量分数为1.0%,菌龄为12h,发酵时间为72h,初始pH值为8.5,菌体干质量为90mg,装液量为20mL.在此条件下,酶活力可达17.020μkat.L-1.另外,在二步发酵工艺中添加0.1%纤维素,酶活力可提高至18.804μkat.L-1,比一步发酵提高1.27倍.

黏质沙雷氏菌产舍雷肽酶的发酵培养基优化

舍雷肽酶具有出色的酪蛋白水解和溶纤活性,临床被应用于多种疾病的治疗或辅助治疗。为了提高黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)发酵产舍雷肽酶的活力,优化了产酶培养基组成及其初始pH和培养时间。首先,通过单因素实验确定了发酵培养基的主要成分;然后,采用响应面分析法优化了麦芽浸粉、酵母浸粉和牛肉膏的质量浓度;最后,考察培养基初始pH和培养时间对产酶活力的影响。实验结果表明:较佳的培养基组成为麦芽浸粉11.9 g/L、酵母浸粉11.3 g/L、牛肉膏6.45 g/L、MnSO_(4)1 g/L、ZnSO_(4)1 g/L、K_(2)HPO_(4)5 g/L和NaCl 5 g/L,初始pH 8.0;在30℃,200 r/min条件下培养36 h,舍雷肽酶活力达到1121 U/mL,较优化前的229.3 U/mL提高了3.89倍。优良的产酶培养基为发酵生产舍雷肽酶的工业化应用打下了基础。