龟裂链霉菌zwf2基因阻断提高土霉素生物合成

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是链霉菌磷酸戊糖途径中第一个酶("看家"酶),也是形成NADPH的关键酶,由zwf1和zwf2基因编码。以温敏型质粒pKC1139为基础构建了用于阻断龟裂链霉菌zwf2的重组质粒pKC1139-zwf2′,通过大肠杆菌GM2929去甲基化pKC1139-zwf2′后电转至原始龟裂链霉菌M4018感受态细胞,筛选得到转化子。转化子进一步通过PCR鉴定和点杂交印迹分析鉴定,证明是zwf2基因阻断的阳性突变子命名为M4018-Δzwf2。以原始菌株为对照,突变子摇瓶发酵结果表明:突变子的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活是原始菌的50%左右,但土霉素生物合成水平则提高了27%;在细胞生长方面,二者均在第4d进入生长稳定期而开始大量合成土霉素,发酵结束时细胞菌体浓度基本相同,但突变子的单位菌丝体土霉素生物合成能力则提高了31%。因此,zwf2的阻断有利于土霉素的生物合成,而对细胞生长没有明显影响。

龟裂链霉菌对废水中Pb^(2+)的吸附作用

为探讨发酵工业中废弃的菌丝体龟裂链霉菌对水中重金属离子的吸附特性 ,考察 p H、温度、粒径大小、共存离子等因素对吸附能力的影响 ,进行了实验室吸附实验 ,绘制出吸附等温线 ,并对化学改性前后的龟裂链霉菌进行了吸附对比 .结果表明 ,龟裂链霉菌对重金属的吸附具有一定的选择性 ,其中吸附 Pb2 + 的能力较高 ,饱和吸附量达 1 1 2 mg/g( p H=4 ) ,吸附过程是一吸热过程 ,以单分子层吸附为主 ,经 Na OH处理的龟裂链霉菌可提高其吸附能力 ,Cu2 + 对吸附有干扰 ,说明存在竞争吸附 .

龟裂链霉菌菌株MY02发酵液中抗菌物质的稳定性测定

本实验室分离获得的链霉菌菌株MY0 2发酵液对植物病原真菌均表现良好的抑菌活性。对其在不同条件下的稳定性进行测定结果表明 ,菌株MY0 2发酵液在中性及偏碱性的条件下稳定 ,室温条件下存放半年后活性开始下降 ,存放 1年后其活性丧失过半 ;菌株MY0 2发酵液对光稳定 ,5 4℃ 15d菌株MY0 2发酵液的抑菌活性不下降。

龟裂链霉菌原生质体诱变与筛选研究

采用定向推理筛选方法对龟裂链霉菌原生质体进行诱变筛选得到 346 #菌株 ,其复筛时比对照产量高 7% ,而在 6 0吨大罐上连续发酵 9批 ,发酵指数比对照高了 13%。

龟裂链霉菌发酵液活性组分SN06对番茄主要防御酶系的影响

用龟裂链霉菌发酵液活性组分SN0 6处理番茄植株后 ,测定了番茄叶片组织内各种防御酶系 (苯丙氨酸解氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、β - 1,3葡聚糖酶 )的活性变化。喷施SN0 6后 ,番茄植株各防御酶系活性明显增强 ,所测定的各种防御酶活性高峰均出现在处理后 3～ 7d。这说明 ,组分SN0 6不仅具有直接的杀菌作用 。

几种诱变因子对龟裂链霉菌的诱变效果

研究了紫外线(UV),LiCl,微波,NaNO2,NTG,NaN3及N+注入7种诱变方法对龟裂链霉菌186#的诱变效果.从致死率、形态变异率、正变率及诱变幅度4方面对诱变效果进行了统计与分析.结果表明,7种诱变因子对菌株均有诱变效果,其中,LiCl、微波、NaNO2及NTG这4种诱变方法操作简单,耗时短,正变率高,变异幅度大,诱变效果良好.

产色链霉菌SY20-2与龟裂链霉菌SY20-4的种间原生质体融合

利用卡那霉素（250 μg/mL）、链霉素（1 000 μg/mL）和罗红霉素（150 μg/mL）标记亲本菌株SY20-2、SY20-4,进行种间原生质体融合.试验结果表明,培养基中加入0.5%～1%甘氨酸可以提高菌丝体对溶菌酶的敏感度,有利于原生质体的释放.溶菌酶不仅影响原生质体的形成,而且影响原生质体的再生率,因此在35℃水浴条件下,SY20-2选择酶浓度2 mg/mL,作用时间30 min;SY20-4选择酶浓度4 mg/mL,作用时间40 min,最适于原生质体的再生.以45%PEG（分子量1 000）作助融剂,融合频率为0.124%,选出153个融合子,其中3株重组子的稳定性及抑菌活性较好,重组子C对烟草野火病菌的抑菌活性比对照要好.

龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)原生质体制备与再生条件研究

报道了龟裂链霉菌（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ） 原生质体制备与再生最佳条件和该原生质体对抗生素的抗性结果。在 Ｓ生长培养基中加入φ＝ １ ％ 甘氨酸进行菌丝体培养２４ ｈ ，原生质体制备最佳条件为：溶菌酶浓度φ＝ ３ ％ 、酶解温度２８ ℃、酶解时间９０ ｍｉｎ ，其制备的原生质体数达到６ ．０ 亿个／ ｍ Ｌ 以上；原生质体最佳再生培养基为 Ｒ５ 再生培养，其再生率达到４６ ％ 。

几种诱变因子对龟裂链霉菌原生质体的影响

作者应用通电、ＵＶ、ＮＴＧ和亚硫酸氢钠等诱变因子对土霉素产生菌——龟裂链霉菌１３８—ｌ原生质体进行处理。结果表明，各种诱变因子在对原生质体致死率５０％左右时具有较好的诱变效应。经亚硫酸氢钠＋ＬｉＣｌ处理获得的Ｃｌ１８菌株通过１６５００１发酵罐试验，最高发酵水平达３３３３０ｕ／ｍｌ，平均发酵水平为３０５４２．５ｕ／ｍｌ，比出发菌株１３８—１提高２０．６％。

龟裂链霉菌GQ-17对Pb^(2+)吸附性的初步研究

采用原子吸收分光光度法研究龟裂链霉菌GQ-17(Streptomyces rimosus GQ-17)菌体对重金属Pb^(2+)的吸附能力,并优化最佳吸附条件,初步探讨了Pb^(2+)对抑菌活性的影响。结果表明,菌株GQ-17在48℃、pH为10.0、初始Pb^(2+)质量浓度为7 000 mg·L-1的条件下处理60 min对Pb^(2+)吸附量最大。此外,在GQ-17发酵初期加入Pb^(2+)质量浓度为700 mg·L^(-1)时发酵液对黄瓜枯萎病菌的抑制活性有所增大。GQ-17的菌体具有重金属离子吸附潜力,并且少量Pb^(2+)的存在能刺激抑菌活性物质的产生。这为研发新型生物吸附剂和提高活性物质产量提供了新资源。

龟裂链霉菌发酵液活性组分对番茄及番茄灰霉病菌的影响

通过电镜观察,单独接种的番茄植株细胞内发现灰霉病菌菌丝,而对照及用SN06处理的番茄植株细胞内未发现灰霉病菌菌丝. 单独用SN06处理的番茄植株结构与对照植株没有差别,叶绿体、线粒体均保持完整结构. 接种前用SN06处理番茄植株与接种后用SN06处理番茄植株相比,番茄植株受灰霉病菌的破坏作用不同,接种前处理效果更好.

紫外线和亚硫酸氢钠对龟裂链霉菌原生质体的诱变作用

用紫外线和亚硫酸氢钠分别处理龟裂链霉菌的原生质体或孢子,结果表明:在相同的条件下,原生质体比孢子对诱变剂敏感;用亚硫酸氢钠处理,原生质体的正变幅度大于孢子。无论用紫外线还是用亚硫酸氢钠处理原生质体,产孢子能力都大大下降。

龟裂链霉菌工业菌中zwf1基因的阻断对土霉素生物合成影响

目的运用代谢工程手段对龟裂链霉菌工业菌(Industrial Streptomyces rimosus,SRI)进行基因改造,提高土霉素(oxytetracycline,OTC)产量。方法利用pKC1139质粒阻断SRI基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)编码基因zwf1。结果筛选得到一株OTC高产突变株,将突变株与原始菌株进行发酵,发现OTC产量比原始菌株提高了36.2%。结论 SRI基因组中zwf1基因的缺失使细胞合成土霉素的能力增强;龟裂链霉菌中初级代谢关键基因调控会影响次级代谢。

龟裂链霉菌zwf2基因敲入及阻断对土霉素合成的影响

目的考察敲入及阻断zwf2基因对6-磷酸葡糖脱氢酶(G6PDH)活性、细胞生长、土霉素合成的影响。方法构建敲入转化子M4018-(zwf2)和阻断转化子M4018-Δzwf2后,以原始菌株为对照,比较敲入转化子菌株M4018-(zwf2)和阻断转化子菌株M4018-Δzwf2摇瓶发酵后G6PDH活性、细胞生长、土霉素合成等生物性质的变化。结果阻断转化子菌株M4018-Δzwf2的G6PDH活性是原始菌的50%左右,敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的G6PDH活性则略高于原始菌;阻断转化子菌株M4018-Δzwf2土霉素生物合成水平比原始菌提高27%,比敲入转化子菌株M4018-(zwf2)高约40%;发酵结束时敲入转化子菌株M4018-(zwf2)的细胞干重高于其他2株菌,其它2株菌的细胞干重差异不大。结论zwf2阻断有利于土霉素的生物合成,zwf2增强则对细胞生长有利。

铜蒸气激光及其与氯化锂复合选育龟裂链霉菌的研究

本文首次报导有关铜蒸气激光及其与氯化锂复合选育龟裂链霉菌的研究。在相同的实验条件下，铜蒸气激光辐照龟裂链霉菌比其随后又氯化锂复合处理的效果好。这是否与修复作用有关，是氯化锂的直接作用，还是氯化锂提高了细胞修复系统的活性而产生的作用。

龟裂链霉菌高产土霉素菌株的诱变筛选及其发酵条件

对出发菌株186-6冻存的孢子悬液进行了活化及复性,先后经过6轮筛选,获得1株高产菌株,命名为P-11.与186-6相比,高产菌株的发酵效价提高了20.75%.对高产菌株进行5次斜面传代,对其遗传特性进行考察,与原始效价相比,高产菌株的效价分别为99.8%,100.2%,98.5%,97.4%,96.6%,说明高产菌株的遗传稳定性良好.对高产菌株特性考察的结果表明:菌种纯度为98.4%,磷耐受性比原始菌株186#有很大提高.代谢参数研究表明,其前期代谢较186#菌株慢.对原发酵培养基进行优化,得到新配方:淀粉120g/L,黄豆饼粉15.5g/L,棉籽饼粉5g/L,CaCO315g/L,(NH4)2SO414.5g/L,NaCl 4.7g/L,玉米浆10g/L,KH2PO40.1g/L,消沫剂0.1g/L,CoCl 0.01g/L,淀粉酶0.12g/L.与原配方相比,土霉素发酵效价提高了25%左右.不同氨基酸对土霉素效价的影响结果表明:对提高土霉素效价起积极作用的3种氨基酸是Thr,Ser和Phe.

透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响

目的考察透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠埃希菌(E.coli)和龟裂链霉菌(S.rimosus)中的表达,研究在不同溶氧条件下表达的透明颤菌血红蛋白(VHb)对龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。方法将vgb插入表达型质粒pET-28a中,导入E.coli BL21(DE3)用以表达VHb并测定其活性。以整合型质粒pSET152为载体,利用erm E*启动子组成型表达vgb基因,将构建的质粒通过接合转移整合到S.rimosus M4018基因组上,利用CO差示光谱法和SDS-PAGE鉴定两个重组菌中的血红蛋白。在5L罐上考察不同溶氧条件下VHb的表达对重组龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。结果重组大肠埃希菌和重组龟裂链霉菌都能够表达具有生物活性的VHb,发酵结果表明,在117h时与对照菌相比,重组龟裂链霉菌在高氧和低氧条件下的干重分别提高了6%和32%,同时单位干重土霉素的产量分别提高了41%和93%。结论 VHb在重组龟裂链霉菌中成功表达,改善了菌体的生长和土霉素的合成,为解决工业发酵过程中氧限制问题提供了策略。

龟裂链霉菌RsigB基因提高大肠杆菌对环境胁迫的耐受性

龟裂链霉菌RsigB是与天蓝色链霉菌与枯草芽孢杆菌中的sigmaB基因同源的一个σ因子,其也可能为一种全局压力调控蛋白,在菌体遇到生长环境改变时起着重要的调控作用。本文以龟裂链霉菌基因组为模版,PCR扩增出RsigB基因,以pET28a为载体,构建重组质粒pET28aRsigB,并且转化至Escherichia coli BL21(DE3)中。将对照菌与重组子置于不同环境胁迫条件下培养,并用IPTG诱导蛋白表达,测其生长曲线,研究RsigB对于大肠杆菌对环境胁迫的耐受性的作用。结果表明,RsigB在大肠杆菌中的表达能够提高其对温度,高渗透压以及氧化还原压力的耐受性。RsigB的成功表达以及对于逆境的耐受性能为龟裂链霉菌中RsigB因子的功能以及机理研究提供实验基础。

龟裂链霉菌中选择性σ因子lsigB在大肠杆菌中的异源表达及功能验证

本文扩增了龟裂链霉菌中选择性调控因子的编码基因lsig B,并在大肠杆菌中进行异源表达。通过SDS-PAGE以及Western blotting方法鉴定Lsig B蛋白后,在多种环境压力下培养重组大肠杆菌。实验结果表明,Lsig B的表达使宿主菌对高温、渗透压、强氧化还原、乙醇以及多种抗生素胁迫的耐受性显著提高。所以Lsig B蛋白是一类能够对环境压力产生应答作用的调控因子,调控了菌体胁迫培养时的应激反应。同时本研究为深入研究Lsig B蛋白在龟裂链霉菌中的抗逆性功能奠定基础。

康宁木霉对龟裂链霉菌MY02诱导活性及其诱导组分的初步分析

利用真菌作为诱导菌株评价其对龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)MY02的活性代谢产物的影响,并对其诱导条件进行优化。当以康宁木霉(Trichoderma koningii)和香菇真菌(Lentinus edodes)作为诱导菌株,黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp.cucumarinum)作为指示菌,以菌株MY02作为被诱导菌株时,康宁木霉和香菇真菌对菌株MY02的抗真菌活性均具有明显的正向诱导作用,菌株MY02的抗真菌活性均比对照明显增强。以康宁木霉作为诱导菌株时,其最佳诱导条件为接种量2%,添加时间为发酵36 h。通过初步分析康宁木霉的诱导组分为其发酵产生的多糖类物质。