黄瓜花叶病毒（CMV）土壤非介体传播研究

对黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）土壤非介体传播的试验结果表明，土壤非介体传播是ＣＭＶ传播的新途径，不同作物间的传播效率有差异，一般ＣＭＶ传入根部后多数地上部不表现症状，但根系生长明显受到影响。文章还分析了ＣＭＶ能够以土壤非介体方式传播的原因。

豆科植物上分离的黄瓜花叶病毒（CMV）五个分离物的比较研究

从豌豆、扁豆、菜豆和赤豆分离到五个ＣＭＶ分离物，除寄主反应及核酸组分外，５个分离物在体外抗性、蚜虫传毒、提纯病毒粒体形态和稳定性、衣壳蛋白分子过和病毒粒体迁移率等方面无明显差异．在琼脂糖双扩散试验中五个分离物与ＣＭＶ抗血清形成的沉淀线相互融合，在Ａ蛋白双抗体夹心ＥＬＢＡ测定中，也无明显差异。根据在四种豆科植物上的症状反应，五个分离物可归为两个型：Ⅰ型在豌豆、蚕豆、菜豆和豇豆上产生局部枯斑症状；Ⅱ型在这四种植物上产生系统症状。五个分离物中，ＣＭＶＰ＿２含有五个枝酸组分，其它分离物为四个组分，即ＣＭＶＰ＿２可能含有卫星ＲＮＡ．

侵染绿花椰菜的黄瓜花叶病毒（CMV）研究

从杭州市郊菜园表现严重花叶、矮化症状的绿花椰菜病株上获得一病毒分离物Ｃ－９３１。汁液摩擦接种６科２１种植物，Ｃ－９３１可侵染其中的６科１９种；体外抗性测定表明Ｃ－９３１的稀释限点（ＤＥＰ）为１０￣（－２），致死温度（ＴＩＰ）为５５－６０℃，２５℃体外存活期（ＬＩＶ）为４ｄ；提纯病毒粒体球形，平均直径２８ｎｍ；在琼脂双扩散反应中Ｃ－９３１能与ＣＭＶ抗血清呈阳性反应；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得其衣壳蛋白亚基分子量为２９ｋＤ；用ＣＦ－１１纤维素柱提取受侵植物组织中ｄｓＲＮＡ，电泳鉴定表明共有５个核酸组分，长度（ｋｂ）分别为３．３，３．０，２．２，０．９和０．３５．根据上述性状，Ｃ９３１被鉴定为黄瓜花叶病毒，且该分离物含卫星ＲＮＡ。

烟草黄瓜花叶病（CMV）发生规律的研究

试验表明，在江西的气候条件下，烟草ＣＭＶ的传播介体（烟蚜）可以安全越冬。在４月中旬至５月中旬（还苗至团棵期），日均气温１７．２～２１．５℃，５日降雨量５０ｍｍ以下、相对湿度８０％以下，有利蚜虫扩散迁飞抵烟田传毒和繁殖，病情重；有翅蚜迁飞高峰后５～１０ｄ即始病，在南昌地区始病期在５月上中旬，盛期在６月上中旬。品种间抗性差异显著，施用Ｎ肥过多、移栽期推迟和离毒源作物近的烟田，发病早而重。

1例异基因造血干细胞移植术后并发CMV和EBV共激活患儿的护理

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是指将健康人的造血干细胞移植至病人体内,目的是帮助其重建造血和免疫功能。越来越多的研究已经证实allo-HSCT是地中海贫血病人能够重新获得生命的主要治疗方法,目前在各大移植中心广泛开展。

CMV通过影响效应因子MpC002的表达干预桃蚜种群增长的机制

【目的】桃蚜是CMV的重要传毒媒介,效应因子MpC002在桃蚜取食寄主过程中发挥关键作用,CMV和MpC002均存在于蚜虫唾液中,但两者如何相互作用从而利于病毒传播知之甚少。为探讨CMV影响MpC002表达干预桃蚜种群增长的机制。【方法】利用绝对定量的qPCR法建立CMV拷贝数检测的标准曲线方程y=-3.1631x+39.763。【结果】桃蚜取食CMV感染辣椒10 s体内CMV含量最高,然后随着取食时间的延长CMV含量不断降低,其获毒过程符合非持久性传毒特征。取食CMV感染辣椒5 min-24 h的桃蚜MpC002表达量显著降低至取食前的37%-58%;取食CMV感染辣椒的3龄、4龄若蚜和1-4龄若蚜的平均发育历期分别为1.58 d、2.07 d和6.47 d,显著长于取食未处理辣椒的1.25 d、1.47 d和5.33 d,但1龄和2龄若蚜发育历期在CMV感染辣椒和未处理辣椒间无显著差异;平均产蚜期、总产蚜量和单日平均产蚜量分别为10.03 d、16.87头和1.67头,显著短于取食未处理辣椒桃蚜的14.27 d,39.73头和2.82头;净增殖率、内禀增长率、周限增长率分别为16.87、0.21、1.24,均显著低于取食未处理辣椒桃蚜的39.73、0.31、1.36,平均世代周期(13.02 d)和种群加倍时间(3.26 d)均显著长于取食未处理辣椒桃蚜的12.00 d和2.30 d。【结论】CMV能显著抑制桃蚜MpC002的表达,从而延长其发育历期和降低其繁殖,最终抑制其种群的增长。

基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

我国不同CMV分离物2b基因片段的RT-PCR扩增及其序列比较

本研究根据黄瓜花叶病毒2b基因的保守序列设计引物,利用一步RT-PCR技术对多个不同寄主和不同地理来源的黄瓜花叶病毒分离物的2b基因片段进行扩增,获得了含该基因全长约90％的cDNA片段(300bp)。序列测定与比较分析结果表明,国内不同CMV分离物2b基因片段核酸序列同源性达93％以上,推测的氨基酸序列同源性超过90％,且均属于亚组Ⅰ。

双抗TMV+CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

在构建 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 双价表 达载体和 建立 辣 椒高 效转 化 体系 的基 础 上用 农杆 菌 介导法转化 辣椒栽培 品种农 大４０ 和湘 研一号。 对５２ 个抗 卡那霉 素再生植 株进行点 杂交 鉴定 ，结果 １６株为 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 阳 性，而 Ｐ Ｃ Ｒ 检测发 现 其中 有 ２ 株 为假 阳性 株。 进一 步 温室 攻毒 试 验 表明有７ 个 阳性转基 因植株 对 Ｔ Ｍ Ｖ 和 Ｃ Ｍ Ｖ 同时表 现为免疫 。

CMV与SP双启动子增强外源基因在小鼠骨骼肌中的表达效率

构建分别含有CMV、肌肉特异启动子SP及双启动子CMV-SP的真核报告基因EGFP表达载体(pCMV-EGFP、pSP-EGFP及pCMV-SP-EGFP)和生长激素释放因子(GRF)表达载体(pCMV-GRF、pSP-GRF和pCMV-SP-GRF).将3种EGFP表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌.注射后1周、2周、3周以及4周时,分别提取肌肉组织RNA,应用半定量RT-PCR检测报告基因(EGFP)的表达量,发现pCMV-SP-EGFP组EGFP表达量显著高于pCMV-EGFP组和pSP-EGFP组(P<0.01);经荧光检测得到了较强的荧光信号.将3种GRF表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌,在注射后每隔10d记录小鼠累积增重,采血并用RIA法测定血清胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)浓度,结果pCMV-SP-GRF组累积增重、IGF-I浓度分别高于生理盐水组、pCMV-GRF组和pSP-GRF组(P<0.05).结果表明:CMV与SP两种启动子组合,在小鼠骨骼肌内使外源基因表达效率提高.本研究为提高外源基因在肌肉组织的表达提供了新的途径.

海藻提取物防治番茄CMV病毒效果及其机理研究

探讨了海藻提取物对番茄CMV病毒的防治作用,结果表明:海藻提取物对CMV有很好的体外钝化效果和预防CMV侵染的作用,其中以3.0g.L-1的浓度较为合理;番茄接种CMV病毒后施用海藻提取物,病株的SOD、POD酶活性明显升高,并明显降低了病株的病毒含量,降低了病毒对叶绿体的破坏。

CP基因转化的线辣椒抗卡那霉素和抗CMV特性的遗传

利用根癌土壤杆菌 ,采用叶盘法转化线辣椒 (Capsicum annuum var.longunt)优良品种陕 82 12 ,建成了能同时表达 CMV和 TMV外壳蛋白基因 (CP基因 )的 T1 代纯合系。以其自交 T2 ～ T4代 ,以及 T2 代植株与未转化陕 82 12杂交的 F1 代和 F2 代群体为试材 ,研究了抗卡那霉素和抗黄瓜花叶病毒 (CMV)特性的遗传传递规律。结果发现 ,抗卡那霉素标记基因和抗病性基因在自交和杂交各代都能稳定地高效表达 ;两者在自交各代纯合 ;在杂交 F1 代抗药性和抗病性都表现为显性 ;在杂交 F2 代 ,抗药植株对敏感植株 ,以及抗病植株对感病植株的分离比都符合 3∶ 1的理论比例。

烤烟CMV抗性基因QTL定位

利用SSR技术,在抗CMV烟草中发掘与抗病基因紧密连锁的分子标记,目的是为抗病基因的定位克隆以及培育抗病新品种奠定基础。本研究以抗CMV的烤烟品种台烟8号、感病品种NC82为亲本,构建BC1代分离群体,对其进行抗性遗传分析。对分布于烟草24条连锁群上的2317个SSR位点进行了多态性筛选,获得了62个稳定多态性标记,利用这些标记对288株BC1群体分型数据,用WinQTLCart2.5进行分析,找到一个与抗性相关的QTL,LOD值为2.6。研究结论表明,台烟8号对CMV的抗性由多基因控制,标记53735与抗性QTL紧密连锁,遗传距离为0.1 cM,该QTL位于10号连锁群,贡献率为13%。

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄及其对CMV的抗性

利用根瘤土壤杆菌Ｔｉ质粒转化系统，采用叶盘法将ＣＭＶ－Ｃｐ基因转入番茄细胞中，获得４２株转基因植株，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，证明ＣＭＶ－ｃｐ基因已进入番茄核染色体中，并能正常表达。通过对转基因植株Ｒ１和Ｒ２代苗期人工接种ＣＭＶ鉴定，发现ＣＭＶ－Ｃｐ基因产物对ＣＭＶ有一定抗性，其抗性遗传符合孟德尔一对基因控制性状的遗传规律并能稳定遗传。

甜(辣)椒导入CMV卫星RNA互补DNA的植株再生

甜(辣)椒(Capsicum annuum L.)是我国主要蔬菜之一,黄瓜花叶病毒(简称CMV)和烟草花叶病毒(简称TMV)常造成甜(辣)椒的严重危害。经过多年的育种实践,人们已经有了较好的抗TMV育种材料。而对CMV,目前还没有可利用的自然抗源和有效的防治措施。国内外在利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行甜(辣)椒的转化研究已有报道。W.Liu等(1990)获得了抗卡那霉素的芽组织并有GUS基因表达;王玉文等(1991)检测到GUS基因在甜椒子叶上的瞬间表达。本试验试图利用农杆菌导入抗CMV基因(CMV卫星RNA互补DNA),以提高甜(辣)椒的抗CMV能力。

真菌多糖对黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制作用

【目的】筛选出对黄瓜花叶病毒(CMV)具有抑制作用的真菌多糖。【方法】采用半叶枯斑法和盆栽试验,测定了猴头菇多糖、云芝多糖、安络小皮伞多糖、灰树花多糖、灵芝多糖、猪苓菌多糖、黑木耳多糖、虫草多糖、香菇多糖和蜜环菌多糖等10种真菌多糖对CMV的室内抑制效果和对烟苗生长的影响;采用间接ELISA以及病情指数调查法,分别测定了云芝多糖对烟苗叶片内CMV含量的影响及对CMV的田间防效。【结果】不同质量浓度真菌多糖对CMV均有一定的抑制作用,抑制效果随着多糖质量浓度的增加而提高,在不同处理中,真菌多糖对CMV的预防效果最好,其次为钝化效果。1 000mg/L的云芝多糖对CMV具有良好的预防作用,防效高达79.83%;对烟苗的生长具有促进作用,烟苗株高、茎围、地上部鲜质量和最大叶面积分别比对照高87.37%,48.28%,58.03%和222.27%。云芝多糖处理后,烟苗叶片内CMV的含量处于较低水平,比对照CMV含量低50.76%～89.96%;田间药效试验显示,云芝多糖在较长的一段时间内对CMV表现出较高的防效,在药后第7,14,21天防效分别达74.30%,68.07%和62.03%,防治效果显著优于对照药剂宁南霉素水剂和病毒A。【结论】云芝多糖对CMV的防治效果良好,具有较好的研究应用价值。

烤烟CMV抗性的主基因+多基因混合遗传模型分析

以高抗CMV的烤烟品种台烟8号为母本(P1),以高感CMV的烤烟品种NC82为父本(P2),在2个不同的时间环境下构建P1、P2、F1和F24个世代群体,在植株不同生长时期进行CMV病害鉴定。运用植物数量性状"主基因+多基因"混合遗传模型分析方法对该世代群体的CMV抗性进行联合分析。结果表明,在温室环境中,苗期和成株期鉴定CMV抗性遗传都符合E1模型,即由2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合控制,主基因遗传率分别是37.11%、57.76%;在大田环境中,苗期抗性鉴定符合加性-显性-上位性多基因模型(C0),多基因遗传率为26.86%,而成株期鉴定属于2对主基因+多基因模型(E2),主基因遗传率为36.57%。研究表明,由于植物抗性基因的表达具有时空性,台烟8号对CMV的抗性遗传在不同的时间和环境具有一定的差异;但随着植株的生长,抗性遗传趋于稳定,在成株期时,2个不同的环境均表现为2对主基因+多基因控制,所以对烤烟CMV抗性品种选育和改良要以主基因为主,同时注重环境的影响。

CMV侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达及代谢响应的研究

【目的】研究黄瓜花叶病毒病(CMV)侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应。【方法】在结合气体交换和叶绿素荧光参数及抗性相关酶活性测定的基础上,应用农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室自主开发的黄瓜cDNA芯片研究黄瓜在CMV侵染胁迫下的基因表达谱变化,并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR(QRT—PCR)进行检测,以验证cDNA芯片杂交结果的可靠性。【结果】共获得67个差异表达显著的基因,其中42个基因下调表达,25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径。许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制;而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达;同时,也发现了一些与CMV胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。【结论】CMV胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化,PR1-1a等基因可能在黄瓜防御CMV侵染过程发挥着重要作用。

转化CMV－cP基因番茄对CMV病毒抗性鉴定

苗期人工接种，对转化ＣＭＶ－ｃＰ基因的番茄品种８８０５Ｒ１～Ｒ４代进行接种ＣＭＶ病毒试验。结果表明：黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因在番茄中的表达，对抑制ＣＭＶ病毒病症状的表现及延迟其发展均起到一定作用。８８０５Ｒ３代对ＣＭＶ的抗性明显高于Ｒ１代，Ｒ４代抗性已基本稳定。当高浓度的ＣＭＶ病毒侵染Ｒ４代植株时，也会出现１００％的发病率，但它们的新生枝叶能正常生长并开花结果。利用半叶法测定８８０５Ｒ。（ｃｐ＋）及８８０５Ｒ４（ｃｐ－）接种叶和新生叶病毒浓度，结果是：ｃｐ（＋）和ｃＰ（－）在接种叶上病毒含量相当，但ｃＰ（＋）的新生叶中病毒含量明显低于ｃＰ（＋）的等位叶，说明ＣＭＶ－ｃＰ基因的存在，限制了ＣＭＶ病毒粒子的迁移和繁衍，最终也减轻了ＣＭＶ病毒的危害程度。

四川烟区CMV和PVY株系分化研究

为了明确当前四川烟区蚜传病毒的株系分化情况,该研究利用RT-PCR技术对四川烟区的CMV和PVY两种蚜传病毒病进行了检测和鉴定.依据病毒的CP基因序列合成引物,以烟草病叶的总RNA为模版,RT-PCR扩增得到了657bp的CMVCP片段和759bp的PVYCP片段,获得的基因片段连接到pGEM-T Easy载体上,测序.样品检测结果显示,在252份样品中CMV和PVY的检出率分别为33.33%和34.52%,两者复合侵染率为15.87%.构建的系统发育树分析结果表明,四川烟区的CMV株系分化不明显,主要属于IB亚组.PVY有着明显的株系分化现象,PVY^(N:O)株系、PVY^O株系、PVY^N株系在四川烟区均有发生.研究结果可能对培育抗病品种,控制这两种蚜传病毒具有一定的参考价值.