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赤眼鳟LGP2序列结构、组织表达及与MDA5互作特征
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作者 李耀国 廖依静 +1 位作者 王静安 肖调义 《水产学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期26-39,共14页
为探究赤眼鳟遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)的功能特征及抗草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)育种参考潜力,实验克隆获得了2940 bp的赤眼鳟lgp2(Sclgp2)全长cDNA和721 bp的5′端上... 为探究赤眼鳟遗传学和生理学实验室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)的功能特征及抗草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)育种参考潜力,实验克隆获得了2940 bp的赤眼鳟lgp2(Sclgp2)全长cDNA和721 bp的5′端上游序列。Sclgp2 cDNA编码680个氨基酸,包含DEXDc(DExD/H-box helicase domain)、HELICc(helicase superfamily C-terminal domain)和CTD(C-terminal regulatory domain)结构域;其5′端上游序列含有MafB(muscle aponeurosis fibromatosis B)和IRF3(interferon regulatory factor 3)等转录因子结合位点。不同物种LGP2的功能结构域、磷酸化修饰位点数具有相似性,同时也存在结构域排布位置及序列的差异。赤眼鳟和草鱼lgp2 cDNA序列比较初步发现2个位于RNA结合功能区的GCRV抗性关联位点。系统进化分析显示,赤眼鳟LGP2先与草鱼、鲫和青鱼聚在一起,再与鲤科鱼类等聚为一大支。荧光定量表达分析显示,赤眼鳟脾脏中sclgp2表达水平显著高于其他组织,肌肉、心脏中表达量次之,而肠中表达量最低。GCRV感染后,肝脏中ifn1表达水平在24~72 h显著下降,其他组织sclgp2和ifn1表达水平未有显著变化。相关性分析结果显示,赤眼鳟肌肉sclgp2与ifn1表达水平呈极显著正相关(0.999)。酵母双杂交互作检测发现,赤眼鳟LGP2与MDA5存在弱相互作用,而其DEXDc(1~201 aa)、HELICc(390~476 aa)以及CTD(553~668 aa)结构域与MDA5无互作。该研究成功获得了sclgp2全长cDNA及5′端上游序列,明确了其序列结构、免疫表达及与MDA5的互作特征,为赤眼鳟LGP2免疫功能属性研究奠定了基础,并为草鱼抗GCRV育种提供了参考。 展开更多
关键词 赤眼鳟 生理学实验室蛋白2(LGP2) 序列结构 表达特征 蛋白互作 gcrv抗性
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基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒RAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立
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作者 肖思民 侯泽玮 +5 位作者 刘方幸妍 赵祎晨 尹纪元 徐伟 吕利群 王浩 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期1905-1914,共10页
为建立一种特异性强、灵敏度高、操作便捷的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)检测方法,研究利用重组酶介导链置换核酸扩增技术(Recombinase-aid amplification,RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,构建了GCRV-Ⅱ病毒RAA... 为建立一种特异性强、灵敏度高、操作便捷的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)检测方法,研究利用重组酶介导链置换核酸扩增技术(Recombinase-aid amplification,RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,构建了GCRV-Ⅱ病毒RAA结合CRISPR/Cas12a可视化“一步”快速检测方法。首先选择GCRV-Ⅱ毒株间序列保守,不同基因型GCRV间差异明显的s6基因(GQ896337)的保守区设计5对RAA候选引物和2对crRNA,合成并筛选出特异性引物和crRNA组合。其次测试反应的特异性、灵敏度和准确性。最后建立下层扩增相、上层检测相的“一步法”反应体系。该检测方法在37℃恒温下反应可检测出GCRV-Ⅱ,最低检测限为10^(2) copies/μL。对24份临床样本进行检测,该检测方法阳性检出率高于现行国标PCR法。研究建立的GCRV-Ⅱ检测方法操作便捷、特异性高、灵敏度好、可重复性强、与设备兼容性好、在蓝光灯下可通过肉眼判断检测结果。 展开更多
关键词 gcrv-Ⅱ RAA CRISPR/Cas12a 现场诊断
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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析 被引量:9
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作者 王杭军 叶星 +2 位作者 田园园 张莉莉 邓国成 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期109-116,共8页
在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列。该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性。为检测VP... 在前期研究中分离到一株草鱼呼肠孤病毒,GCRV-GD108,并获得其全基因组序列。该病毒株的M5基因编码VP5蛋白,该蛋白与哺乳动物正呼肠孤病毒μ2蛋白具有较高的同源性及相似的NTPase结合保守区域,推测VP5蛋白也同样具有NTPase活性。为检测VP5蛋白是否具有NTPase活性及其是否具有免疫保护作用,采用已构建的原核表达载体表达VP5重组蛋白,通过孔雀绿钼酸铵法检测纯化后的重组蛋白的NTPase活性。采用DNAstar软件预测M5基因编码蛋白的抗原性,综合蛋白亲水性、表面可及性与表面抗原性三项指标,预测编码蛋白可形成抗原表位的氨基酸区域数多达86个,提示VP5蛋白具有较强的免疫原性。用重组蛋白VP5免疫健康草鱼,通过人工攻毒实验检测VP5蛋白的免疫保护作用。结果显示,VP5重组蛋白具有NTPase活性,且其NTPase活性依赖于Mg2+或Na+/K+,而Ca2+的存在可能抑制其活性;VP5蛋白可诱导草鱼产生高水平的抗体滴度,并显著提高IgM mRNA的表达水平,但未能为草鱼提供抗GCRV感染的保护。研究首次证实GCRV-GD108株VP5蛋白具有NTPase活性,但不能为草鱼提供免疫保护作用。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒gcrv-GD108株 重组VP5蛋白 核苷三磷酸酶 活性 免疫原性
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草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV_(991))的病毒学特性分析 被引量:17
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作者 方勤 肖调义 +3 位作者 丁清泉 李旅 章怀云 朱作言 《中国病毒学》 CSCD 2002年第2期179-181,共3页
从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒 (GCRV991) ,该病毒能使草鱼CIK ,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE ,对水生动物BF2 ,EPC及哺乳动物BHK ,VERO细胞株不敏感。中和实验显示 ,GCRV873 抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒 ,形成抗... 从湖南长沙分离到一株致病性强的草鱼呼肠孤病毒 (GCRV991) ,该病毒能使草鱼CIK ,肥头鲤FHM细胞产生明显的CPE ,对水生动物BF2 ,EPC及哺乳动物BHK ,VERO细胞株不敏感。中和实验显示 ,GCRV873 抗体能有效地中和GCRV991病毒颗粒 ,形成抗原抗体免疫复合物。纯化的病毒核酸与蛋白经SDS PAGE分离 ,分别呈现 11条清晰的核酸带及 5条主要与 2条微量结构多肽图谱 ,其核酸蛋白分子量大小与GCRV873 相近似。该毒株基因组总分子量为 14.48× 10 6kD ,大小范围是 0 .5 5~ 2 .6 1× 10 6kD ;5条主要与两条微量结构多肽分子量近似值分别为136kD、132kD、6 5kD、43kD、34kD及 138kD、82kD。上述结果提示 ,新分离的GCRV991与GCRV873 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 分离株 gcrv991 病毒学特性
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草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白的原核表达 被引量:3
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作者 王杭军 叶星 +3 位作者 田园园 张莉莉 瞿兰 张蕊 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期97-102,共6页
根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间... 根据草鱼呼肠孤病毒广东株GCRV-GD108编码VP5的M5基因的cDNA序列,分别设计合成带特定酶切位点的特异引物,进行PCR扩增;通过酶切与连接,构建2种重组表达载体pET30c-M5和pColdⅡ-M5,分别转化于大肠杆菌并进行诱导表达;对培养基、诱导时间、诱导剂浓度和温度等条件进行优化,确定最适表达体系。通过SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。结果显示,所构建的2种VP5蛋白原核表达载体,均在大肠杆菌中成功表达了分子质量大小(约80ku)与预期相符的重组蛋白,表达产物主要存在于包涵体中。诱导表达后的菌体经离心、洗涤与超声破碎,离心收集包涵体。包涵体通过变性、透析与复性,获得纯化的重组蛋白,其中pET30c-M5/BL21(DE3)工程菌的目的蛋白占全菌蛋白的22.5%,纯化后获得了高纯度的重组蛋白(>95%)。比较2种表达载体的表达结果,pET30c-M5具有诱导表达耗时少、获得重组蛋白量大的优势,可为下一步的研究提供足量的蛋白。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒gcrv-GD108株 M5基因 免疫印迹 原核表达 纯化
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GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性 被引量:1
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作者 肖调义 周智愚 +4 位作者 王荣华 李耀国 金生振 李伟 王红权 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第8期1308-1318,共11页
为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表... 为探究GCRV弱毒疫苗母源性免疫的草鱼母本及其子代免疫因子(IgM、C3、LSZ)表达特性及代间传递效应,采用ELISA、Rt-q PCR等方法检测了草鱼母本产前40 d接种疫苗后,母本血液、子代早期发育阶段及2月龄幼鱼3种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平。结果显示,经GCRV弱毒疫苗免疫的草鱼母本血液、早期胚胎及幼鱼阶段IgM蛋白活性均显著高于对照组样品。子代各阶段中,28日龄的夏花样品IgM蛋白活性水平最高,而5日龄水花样品中蛋白活性最低;从受精卵发育至3日龄水花阶段,实验组样品免疫因子C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组;2组鱼中IgM、C3和LSZ蛋白的活性水平随着发育进行,总体上呈先下降后升高的趋势,从卵细胞至3日龄水花阶段实验组样品C3和LSZ蛋白活性水平均显著高于对照组。实验组和对照组受精卵IgM基因的表达水平差异最大,实验组表达量为对照组的3.4倍。从24 h器官形成期至3日龄水花样品中,实验组C3基因的表达水平显著高于对照组。从卵细胞至3 h囊胚期阶段,实验组LSZ基因表达水平显著高于对照组。实验组2月龄草鱼体肾、头肾、脾脏组织中IgM基因表达量均显著高于对照组;感染GCRV病毒后,实验组死亡尾数(2尾)低于对照组死亡尾数(5尾)。研究表明母源性免疫可在草鱼进行代间传递,并对子代起到一定程度的免疫保护作用。 展开更多
关键词 草鱼 gcrv 母源性免疫 早期发育 免疫因子
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Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒在稀有鮈鲫中的传播途径
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作者 倪秦伟 孙阳 +1 位作者 刘林怡 吕利群 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期139-148,共10页
为了研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)的流行规律,本实验基于稀有鮈鲫感染GCRV-JX02的研究模型,利用分子生物学检测、逆转录实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR)等方法开展GCRV-Ⅱ水平和垂直传播的研究。结果显示,水平传播中浸泡感染和共培... 为了研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV-Ⅱ)的流行规律,本实验基于稀有鮈鲫感染GCRV-JX02的研究模型,利用分子生物学检测、逆转录实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR)等方法开展GCRV-Ⅱ水平和垂直传播的研究。结果显示,水平传播中浸泡感染和共培养感染都能使稀有鮈鲫成为GCRV-Ⅱ的无症状携带者,阳性检出率分别为50%和80%;其中共培养感染直接导致8%的稀有鮈鲫死亡。感染后无症状的稀有鮈鲫经热休克处理,浸泡感染与共培养感染组的死亡率分别为57.14%和100%,总体阳性检出率分别为80.95%和100%。腹腔注射感染GCRV-JX02后存活的无症状稀有鮈鲫每0.01 g精巢与卵巢中病毒拷贝数分别为3.64×10^(6)和6.84×10^(6)个。垂直传播实验中稀有鮈鲫单个的卵子、未受精卵、受精卵和幼鱼的平均病毒拷贝数为1.98×10^(3)、1.15×10^(4)、4.75×10^(3)和6.74×10^(4)个,幼鱼中病毒的拷贝数显著高于卵子与受精卵时期,表明GCRV-JX02不仅能够在稀有鮈鲫中垂直传播,还能伴随幼鱼的发育不断扩增。本研究阐明了不同传播途径下GCRV-Ⅱ的传播潜力,有助于评估草鱼出血病的流行风险,且为筛选阻断草鱼呼肠孤病毒传播的药物提供了有效的动物模型。 展开更多
关键词 稀有鮈鲫 草鱼呼肠孤病毒 水平传播 垂直传播 热休克处理
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赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性 被引量:2
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作者 陈开健 王静安 +4 位作者 刘巧林 王荣华 徐莹 赵鑫 肖调义 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期641-646,共6页
为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性,采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp),其中包含5′端非编码区50 bp,开放阅读框1 629 bp,3′端非编码... 为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性,采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp),其中包含5′端非编码区50 bp,开放阅读框1 629 bp,3′端非编码区942 bp;该基因编码542个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为61670,理论等电点为6.01。SMART结构分析结果显示,TRAF6基因编码的蛋白包含1个RING结构域、2个锌指结构域、1个螺旋卷曲结构域和1个MATH结构域。系统进化树分析结果表明,赤眼鳟TRAF6与团头鲂TRAF6的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,在中肠中的表达量最低;经GCRV感染后,赤眼鳟脾脏和头肾中TRAF6均呈波动上调趋势,在24 h达到峰值,表明TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应。 展开更多
关键词 赤眼鳟 肿瘤坏死因子受体相关因子6基因 草鱼呼肠孤病毒(gcrv)
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草鱼jam-a分子在胚胎幼鱼期及受GCRV感染PSF细胞的表达分析 被引量:1
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作者 田园园 焦真真 +4 位作者 孙成飞 董浚键 江小燕 胡婕 叶星 《渔业科学进展》 CSCD 北大核心 2019年第5期126-133,共8页
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)可引发草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病,导致高死亡率。草鱼吻端成纤维细胞(Grass carp snout fibroblast cells, PSF)是GCRV的敏感细胞系。JAM-A (Junctional adhesion molecule A)为... 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)可引发草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病,导致高死亡率。草鱼吻端成纤维细胞(Grass carp snout fibroblast cells, PSF)是GCRV的敏感细胞系。JAM-A (Junctional adhesion molecule A)为免疫球蛋白超家族成员,是多种病毒的细胞受体。本研究在前期克隆到草鱼3种jam-a基因,命名为gcjam-a1,gcjam-a2和gcjam-a3。在获取ORF序列的基础上,利用qRT-PCR分析了3种gcjam-a在草鱼胚胎及幼鱼不同发育时期及PSF细胞中受GCRV(GD108株)感染前后的表达模式。结果显示,检测的13个胚胎及幼鱼发育时期中,gcjam-a1在未受精卵中高表达,在受精卵至出膜前的胚胎表达水平均较低;从出膜后1~3 d表达量开始上升;出膜6~15 d均呈高水平表达。gcjam-a2与gcjam-a3在草鱼胚胎及幼鱼发育各阶段表达水平较低。在无病毒感染的PSF细胞中,gcjam-a只有少量表达。受GCRV-GD108感染后,病毒S7基因在PSF细胞中的拷贝数随时间呈显著上调趋势,gcjam-a的表达量也有不同程度的上调,mR NA上调水平为gcjam-a1>gcjam-a2>gcjam-a3。本研究证实了3种gcjam-a基因在PSF细胞中的表达均与GCRV-GD108感染相关,其中,gcjam-a1的表达水平受GCRV-GD108感染影响最大,同时,它在孵化出膜后表达上升,推测它可能与病毒的感染更相关。gcjam-a1可作为下一步GCRV与宿主互作研究中的候选分子。 展开更多
关键词 草鱼吻端成纤维细胞 gcrv gcjam-a qRT-PCR 胚胎及幼鱼发育 病毒受体
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GCRV及其细胞灭活苗对草鱼4种酶活性的影响 被引量:1
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作者 袁雪梅 沈锦玉 +5 位作者 蔺凌云 潘晓艺 姚嘉赟 徐洋 尹文林 郝贵杰 《生物学杂志》 CAS CSCD 2014年第2期30-34,共5页
以G1组1×106TCID50/mL、G2组1×103TCID50/mL两种不同浓度草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼,G3组用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗注射免疫草鱼,并设计对照组:用相同体积的PBS腹腔注射草鱼,分别在注射后1、2、7、14 d取血清及肝... 以G1组1×106TCID50/mL、G2组1×103TCID50/mL两种不同浓度草鱼呼肠孤病毒通过腹腔注射感染草鱼,G3组用草鱼呼肠孤病毒细胞灭活苗注射免疫草鱼,并设计对照组:用相同体积的PBS腹腔注射草鱼,分别在注射后1、2、7、14 d取血清及肝脏,测定其酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性,通过各项酶活力变化规律来研究病毒感染及疫苗免疫对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果表明:ACP活性,与对照组比较血清中各处理组变化不显著,肝脏中大体呈现先降低后升高的趋势;AKP活性,血清中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2、G3组呈现持续升高的趋势,肝脏中G1、G2组均呈现先降低再升高再降低的趋势,G3组呈现先升高再降低的趋势;MPO活性,血清中G1组呈上升趋势,G2组呈先升高再下降的趋势,G3组呈现升高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先降低再升高再降低的趋势,G2组与G3组均呈现先升高再降低的趋势;SOD活性,血清中G1组呈现先升高再降低的趋势,G2组呈现升高的趋势,G3组呈现先高再降低再升高的趋势,肝脏中G1组呈现先升高后降低的趋势,G2组呈现降低的趋势,G3组呈现先降低后升高的趋势。结果显示:MPO及SOD两种酶活性在G1、G2及G3血清中变化趋势不一,说明这两种酶活性跟刺激物浓度及种类存在一定关系。 展开更多
关键词 草鱼 草鱼呼肠孤病毒 细胞灭活苗 酶活性
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The VP2 protein of grass carp reovirus(GCRV) expressed in a baculovirus exhibits RNA polymerase activity 被引量:4
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作者 Liming Yan Huan Liu +1 位作者 Xiaoming Li Qin Fang 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2014年第2期86-93,共8页
The double-shelled grass carp reovirus (GCRV) is capable of endogenous RNA transcription and processing.Genome sequence analysis has revealed that the protein VP2,encoded by gene segment 2 (S2),is the putative RNA... The double-shelled grass carp reovirus (GCRV) is capable of endogenous RNA transcription and processing.Genome sequence analysis has revealed that the protein VP2,encoded by gene segment 2 (S2),is the putative RNA-dependent RNA polymerase (RdRp).In previous work,we have ex-pressed the functional region of VP2 that is associated with RNA polymerase activity (denoted as rVP2390-900) in E.coil and have prepared a polyclonal antibody against VP2.To characterize the GCRV RNA polymerase,a recombinant full-length VP2 (rVP2) was first constructed and expressed in a baculovirus system,as a fusion protein with an attached His-tag.Immunofluorescence (IF) assays,together with immunoblot (IB) analyses from both expressed cell extracts and purified Histagged rVP2,showed that rVP2 was successfully expressed in Sf9 cells.Further characterization of the replicase activity showed that purified rVP2 and GCRV particles exhibited poly(C)-dependent poly(G) polymerase activity.The RNA enzymatic activity required the divalent cation Mg2+,and was optimal at 28 ℃.The results provide a foundation for further studies on the RNA polymerases of aquareoviruses during viral transcription and replication. 展开更多
关键词 grass carp reovirus (gcrv) VP2 protein baculovirus recombinant RNA polymerase
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逆转录环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)的研究 被引量:1
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作者 郝贵杰 林锋 +6 位作者 陈智慧 黄小红 潘晓艺 袁雪梅 徐洋 姚嘉赟 沈锦玉 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期183-191,共9页
草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop... 草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是一种双链分节段RNA病毒,是引起草鱼出血病的(hemorrhage of grass carp)的病原,目前临床上较为流行的为基因I型和II型GCRV。本研究利用逆转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法(lateral flow dipstick,LFD)进行可视化检测,分别建立了可应用于基因I型和II型GCRV快速检测的RT-LAMP-LFD技术。该技术以基因I型和II型GCRV第六基因为检测靶标,分别设计了2对特异性引物(其中,上游内引物由生物素biotin标记)和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针。结果表明,RT-LAMP最适反应温度为63oC,扩增时间为40min,从核酸扩增到LFD结果判读仅需50min。利用RT-LAMP-LFD可特异性检出基因I型和II型GCRV,而对鲤疱疹病毒II型(Cy HV-2)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、嗜水气单胞菌等鱼类常见病原的核酸检测结果为阴性,而且两种基因型RT-LAMP-LFD方法只能检测本基因型GCRV,特异性良好。该方法最低可检测到1.19pg的基因I型GCRV的RNA,1.88pg基因II型GCRV的RNA,其灵敏度分别比相应的RT-PCR方法高2个数量级和1个数量级。对实际样品的检测结果表明,两种基因型RT-LAMP-LFD方法检测GCRV与普通RT-PCR扩增并测序的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出GCRV,而且操作简单,费用低且耗时短,不需特殊仪器设备,有望成为GCRV现场检测的常规技术手段。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 横向流动试纸条(LFD) 特异性 灵敏度
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草鱼呼肠孤病毒(GCRV)部分基因片段cDNA文库的构建 被引量:7
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作者 方勤 田静 《中国病毒学》 CSCD 2000年第1期78-82,共5页
在随机六聚体引物浓度不变条件下 ,分别采用 0 .5、2、5μg草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)单一片段RNA进行反转录cDNA合成及文库构建。结果表明 ,在GCRV RNA模板浓度大于 2 μg时 ,第二链cDNA合成产物可直接通过EB染色的琼脂糖凝胶电泳进行定量... 在随机六聚体引物浓度不变条件下 ,分别采用 0 .5、2、5μg草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)单一片段RNA进行反转录cDNA合成及文库构建。结果表明 ,在GCRV RNA模板浓度大于 2 μg时 ,第二链cDNA合成产物可直接通过EB染色的琼脂糖凝胶电泳进行定量及鉴定。选择cDNA与载体连接比率为 5∶1,在高效电转化条件下 ,可获得 10 6 转化子 /μgcDNA的转化效率。阳性克隆子经酶切及PCR鉴定 ,约 4 5%以上的插入片段大于 50 0bp。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 双链RNA CDNA文库
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草鱼出血病分子流行病学及GCRV多样性研究 被引量:5
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作者 黄毅昌 雷燕 +3 位作者 杨玉滔 闫秀英 简纪常 吴灶和 《安徽农业科学》 CAS 2016年第11期120-125,153,共7页
[目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为... [目的]分析不同基因型GCRV分离株与患草鱼出血病草鱼症状的相关性。[方法]采用RT-PCR检测患病草鱼,应用生物信息学方法分析基因型内和基因型间不同分离株间的差异。[结果]对近3年来草鱼出血病分子流行病学分析发现,患草鱼出血病病鱼多为"肠炎型"症状,且检测发现其病原多属于GCRV基因型Ⅲ型。对GCRV的多样性分析表明,不同分离株同源蛋白的同源率高达93%以上,却被给予完全不同的名称,给GCRV多样性研究带来一定的困难;同一基因型不同分离株同源蛋白间的变异位点较少,且功能位点发生变异的更少;不同基因型不同分离株同源蛋白间的保守位点较少,且这些保守位点中只有极少数位点为功能位点;不同基因型分离株同源结构蛋白间存在较大的差异,且同源非结构蛋白间的差异更为显著。[结论]草鱼出血病不同临床症状可能与其病原基因型不同有关。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 草鱼出血病 分子流行病学 多样性
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草鱼感染GCRV后血液中淋巴细胞变化及BCL10表达分析 被引量:1
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作者 姜祝祥 郭早枣 +1 位作者 郑国栋 邹曙明 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期514-520,共7页
为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制,文章克隆了BCL10基因,并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示,BCL10基因开放阅读框为738 bp,编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,感染病... 为了研究草鱼BCL10基因在草鱼出血病中的应答机制,文章克隆了BCL10基因,并利用生物信息学、荧光定量和血涂片等技术对其进行了分析。生物信息学结果显示,BCL10基因开放阅读框为738 bp,编码245个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,感染病毒后草鱼体内BCL10表达量持续上调,在肝胰腺和中肾中第4天达到峰值,第7天表达量开始下调。血涂片显微镜观察发现了血液中淋巴细胞在感染病毒后第1到第4天下降,第7天时上升。肾脏的组织病理学观察也发现中肾中肾小管上皮细胞第1到第7天逐渐空泡化,脱落坏死。以上结果表明,BCL10基因参与了草鱼应对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)入侵的免疫应答。 展开更多
关键词 gcrv BCL10 表达分析 血淋巴细胞 组织观察 草鱼
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草鱼Noxa基因克隆及其应答GCRV入侵的表达响应
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作者 卢肖男 黄容 +2 位作者 廖兰杰 朱作言 汪亚平 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期58-62,共5页
研究通过获得草鱼Noxa基因(Cinoxa)全长c DNA,进行序列分析和进化树构建,使用定量PCR(q PCR)的方法研究其在GCRV刺激下的表达模式。研究发现,草鱼Noxa基因的蛋白序列与斑马鱼Noxa基因具有高度相似性。通过分析草鱼和斑马鱼的Noxa基因的... 研究通过获得草鱼Noxa基因(Cinoxa)全长c DNA,进行序列分析和进化树构建,使用定量PCR(q PCR)的方法研究其在GCRV刺激下的表达模式。研究发现,草鱼Noxa基因的蛋白序列与斑马鱼Noxa基因具有高度相似性。通过分析草鱼和斑马鱼的Noxa基因的蛋白三维结构(3D)模型,研究发现两者具有高度一致的蛋白三维结构模式,该模型与高等哺乳类中的Bcl-2家族蛋白中C端结构域同源。对Cinoxa在GCRV刺激下的表达模式的研究表明,Cinoxa在GCRV感染后中肾、脾脏和头肾中表达发生显著性变化,攻毒后24h和120h出现显著上调表达。研究表明草鱼Noxa为斑马鱼Noxa的同源基因,并且参与了草鱼对GCRV入侵的应答反应,为深入研究鱼类Noxa应答病毒入侵的功能和转录调控机制奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼 Cinoxa gcrv刺激 基因表达 应答反应
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稳定表达草鱼LamR鱼类细胞的建立及对基因Ⅱ型GCRV增殖的影响
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作者 黄志深 王庆 +4 位作者 吴斯宇 周文礼 王英英 尹纪元 李莹莹 《淡水渔业》 CSCD 北大核心 2021年第4期21-26,共6页
通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采... 通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建。采用Ⅱ型GCRV分别接毒CiLamR稳定表达EPC和CIK,检测接毒后Ⅱ型GCRV拷贝数差异,研究草鱼37 kDa/67 kDa层粘连蛋白受体(37 kDa/67 kDa laminin receptor,LamR)对Ⅱ型GCRV增殖的影响。结果显示:经PCR扩增获得927 bp CiLamR完整开放阅读框(ORF),并成功克隆进入真核表达质粒pEYFP-Mem,获得pEYFP-Mem-CiLamR重组质粒,转染并经过G418筛选后获得约80%阳性荧光的细胞。Western Blot证实稳定表达CiLamR的EPC和CIK细胞系构建成功。以不同初始浓度接种EPC-pEYFP-Mem、EPC-pEYFP-Mem-CiLamR细胞均未检测到Ⅱ型GCRV增殖,CIK-pEYFP-Mem、CIK-pEYFP-Mem-CiLamR可检测到病毒增殖,但是增殖量无明显差异。结果表明:CiLamR蛋白对基因Ⅱ型GCRV增殖无明显影响。 展开更多
关键词 草鱼(Ctenopharyngodon idella) 层粘连蛋白受体 稳定表达细胞系 基因Ⅱ型 gcrv
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基因Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒病毒样颗粒的构建与鉴定 被引量:1
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作者 郜婷 吴斯宇 +6 位作者 高彩霞 夏苏东 尹纪元 王英英 李莹莹 石存斌 王庆 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期148-157,共10页
为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。实验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^(TM),... 为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)病毒样颗粒(VLPs)疫苗,实验利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)将具有免疫原性的GCRV-VP3/VP4/VP35蛋白进行GCRV-VLPs的组装。实验将编码VP35蛋白的GCRV-s11基因克隆入杆状病毒载体pFastBacHTA^(TM),然后将鉴定正确的重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,筛选得到重组穿梭质粒Bacmid-VP35。将穿梭质粒Bacmid-VP35以及实验室前期构建的重组穿梭质粒Bacmid-VP3、Bacmid-VP4分别转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4。利用Bac-PAK快速滴定试剂盒测定重组杆状病毒滴度,并通过间接免疫荧光(IFA)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白的表达情况。结果显示,实验获得了较高滴度的重组杆状病毒,并且重组蛋白在杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中正确表达。将成功表达蛋白的重组杆状病毒pFHB-VP35、pFHB-VP3以及pFHB-VP4共感染Sf9细胞组装GCRV-VLPs,通过透射电镜(EM)观察VLPs的组装情况。结果显示,GCRV-Ⅱ的3个蛋白在Sf9昆虫细胞中可以完成自我组装,形成与天然病毒结构形似的VLPs,直径为65~72 nm。本实验结果为进一步研制安全、高效的GCRV-VLPs疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼 草鱼呼肠孤病毒 重组杆状病毒 病毒样颗粒
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草鱼呼肠孤病毒纤维蛋白VP56与草鱼GRP78蛋白互作诱导内质网应激 被引量:1
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作者 苏航 苏建国 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期155-162,共8页
为了阐明草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的感染机制,深入探究VP56(Ⅱ型和Ⅲ型GCRV特有的纤维蛋白)与宿主细胞蛋白的相互作用。实验通过免疫共沉淀(co-IP)发现,VP56与细胞内定位于内质网的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)发生相互作用。而后,... 为了阐明草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的感染机制,深入探究VP56(Ⅱ型和Ⅲ型GCRV特有的纤维蛋白)与宿主细胞蛋白的相互作用。实验通过免疫共沉淀(co-IP)发现,VP56与细胞内定位于内质网的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)发生相互作用。而后,VP56与GRP78的互作通过基于远红外红色荧光蛋白mNeptune的双分子荧光互补系统(BiFC)得到验证。在VP56稳定表达的草鱼肾细胞系(CIK)中,相较于CIK细胞,内质网则形态发生巨大变化,产生肿胀、扩张、脱粒等现象,说明VP56激活内质网应激。通过对内质网应激下游转录因子的mRNA水平检测,发现VP56激活活化转录因子6(ATF6)介导的信号转导途径,激活非折叠蛋白反应。研究表明,GCRV-Ⅱ感染过程中破坏了细胞稳态、激活内质网应激。本研究为GCRV感染机制和抗GCRV病毒研究提供了新思路,揭示了一种新的病毒逃逸机制,有助于淡水养殖产业中草鱼出血病的防控。 展开更多
关键词 草鱼 草鱼呼肠孤病毒 纤维蛋白VP56 葡萄糖调节蛋白78 内质网应激
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感染唐鱼的草鱼呼肠孤病毒分离与鉴定
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作者 吴江 赵现锋 +7 位作者 陈兵 安微 孙洁 林彦星 王津津 廖立珊 赵永刚 兰文升 《中国动物检疫》 CAS 2023年第6期31-37,共7页
广东省某渔场待出境送检唐鱼(Tanichthys albonubes)样品,经病理检查未发现临床症状,取样品的肝、脾和肾等器官组织,用细胞分离培养方法检测病毒性因子,发现该批次唐鱼样品的组织提取物能够造成EPC和CHSE-214细胞发生细胞病变效应(CPE)... 广东省某渔场待出境送检唐鱼(Tanichthys albonubes)样品,经病理检查未发现临床症状,取样品的肝、脾和肾等器官组织,用细胞分离培养方法检测病毒性因子,发现该批次唐鱼样品的组织提取物能够造成EPC和CHSE-214细胞发生细胞病变效应(CPE),确定该样品携带病毒性病原。为探究唐鱼携带病原的种类,针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)S9核酸片段设计特异性引物,对产生CPE的细胞培养物进行RT-PCR核酸扩增和序列测定,用EPC细胞扩增该病毒,获得病毒含量为10^(6.25)TCID_(50)/mL的细胞培养物,通过高通量测序技术分析细胞培养物中的病毒类型,并用不同病毒含量的细胞培养物进行唐鱼感染性试验。测序结果经BLAST比对分析发现,扩增序列与GCRV 873株的S9核苷酸序列同源性达98%,鉴定病原为GCRV,将其命名为GCRV SZ0508株。全基因组测序序列注释为GCRV,通过vp2基因遗传进化分析发现,GCRV SZ0508属于I型GCRV。感染性试验中,感染组100%被感染,死亡率为3.3%,表明分离的GCRV能够感染唐鱼,具有造成唐鱼发生草鱼出血病的风险。 展开更多
关键词 唐鱼 草鱼呼肠孤病毒 Illumina高通量测序技术
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