变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术在分析动物肠道菌群多样性中的应用

变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术在16S rRNA分析技术的基础上进一步对微生物多样性进行分析,具有重复性好,快速高效检测突变DNA片段的优点。PCR-DGGE技术对于动物肠道菌群引导转化、细菌性疾病的防治和肠道菌群结构的研究等具有重要的意义。本文主要介绍了PCR-DGGE技术的基本分析方法与应用。

基于PCR-DGGE技术分析浓香白酒窖泥梭菌多样性

窖泥是浓香型白酒酿制过程中最主要的微生物源,窖泥中微生物的类型、丰度、新陈代谢活动等均对浓香型白酒品质产生很大的影响。为探究窖泥中梭菌微生物的多样性,利用窖泥理化结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术对10个窖泥样品中的梭菌群落及变化规律进行研究。结果表明,所选10个窖泥的理化参数均符合优质窖泥指标要求;在微生物层面,窖泥中检测到的梭菌在属水平上有:嗜碱菌属、丁酸弧菌属、梭菌属、喜热菌属、瘤胃梭菌属、粪球菌属、沉淀杆菌属(Sedimentibacter)、钙原杆菌属(Caldicoprobacter)、温带菌(Tepidimicrobium)、梯氏菌(Tissierella)、孢子菌(Sporanaerobacter)、硫酸盐还原菌属、鲁替孢菌属和梭状芽胞杆菌(Clostridiisalibacter)等,这些菌是优质窖泥的重要指示菌,可知窖泥中含有极其丰富的酿酒功能菌。揭示了可能在白酒酿造中起关键作用的梭菌菌群,在分子水平上为研究浓香型白酒提供了理论依据。

PCR-DGGE技术分析韩式大酱与中式大酱中微生物多样性

微生物在大酱发酵过程中起到至关重要的作用,并与大酱的风味与质量密切相关,因此研究大酱中微生物的多样性有重要意义。该研究选择加工工艺不同的韩式大酱与中式大酱为对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术,通过PCR扩增、切胶回收、PCR测序等分析不同大酱中的微生物多样性。结果表明,大酱中的微生物由于制作工艺的不同存在明显差异。在韩式大酱中,细菌如芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、四联球菌属(Tetragenococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas),真菌如根毛霉属(Rhizomucor)、青霉菌属(Penicillium)、毛霉属(Mucor)、外瓶霉属(Exophiala)、曲霉属(Aspergillus)等分布广泛。在中式大酱中,乳酸菌如片球菌属(Pediococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucanostoc)、肠杆菌属(Enterobacter),酵母如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)分布较多。与中式大酱相比,韩式大酱中的真菌种类更丰富。研究结果为进一步探讨传统发酵大酱品质提供了理论依据。

芝麻香型高温大曲制曲过程中理化生化与细菌DGGE指纹图谱的探究

采用16S rRNA、PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,在芝麻香型高温大曲培曲及前期储存期间进行采样,并分别对高温大曲的各项理化生化指标变化规律及细菌DGGE指纹图谱进行综合分析,揭示了在高温制曲及贮存进程中,各项理化生化指标的变化规律及细菌种类具有多样性及相似性,该探究为指导高温大曲功能微生物筛选应用、优化提升大曲制作工艺提供参考。

凡纳滨对虾咸淡水养殖系统内细菌群落组成的PCR-DGGE分析

采用PCR(polym erase chain reaction)-DGGE(denaturing grad ient gel electrophoresis)及传统的微生物培养方法对凡纳滨对虾Litopenaeus vannam ei咸淡水养殖系统内各种环境的细菌群落组成进行了比较研究。传统的微生物培养计数表明,从海湾水、养殖池水到对虾粪样,细菌和弧菌的数量表现出依次增加的趋势,粪样及肠壁中弧菌的数量高出外界水环境1—4个数量级。相对于外界水环境,粪样中有很高的芽孢杆菌孢子含量,但是肠壁定植细菌中不存在芽孢杆菌(孢子)。PCR-DGGE及聚类分析结果表明,从海湾沿岸、养殖池、对虾粪便到对虾肠壁,细菌群落的多样性由高到低,无论是在哪种环境,群落的优势种都十分明显,且只有2—4种。来自同一环境各样品间的细菌群落组成非常相似,来自不同环境的样品,其细菌群落组成差别较大。聚类图上各簇的排列顺序反映了样品在取样空间分布上的毗邻次序和它们的相似程度。

重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析

国内首次运用FastPrep○R 核酸快速提取系统提取了重金属复合污染农田土壤的DNA ,并对其进行了聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳 (PCR DGGE)分析。结果表明 ,FastPrep○R核酸提取仪与相应的FastD NASPINKitforSoil试剂盒联用时 ,能有效地分离到纯度较高的重金属污染农田土壤的DNA。PCR DGGE电泳图谱表明 ,PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好 ,可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤 ,影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 ,改变了土壤环境的优势菌群 ,从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。可见 ,FastPrep○R核酸提取系统同样适用于重金属污染农田土壤环境中微生物基因组DNA的快速分离和纯化 ,得到的DNA可直接用于PCR DGGE分析。

PCR-DGGE研究处理垃圾渗滤液序批式生物膜反应器(SBBR)中的细菌多样性

为了研究序批式生物膜反应器中的细菌多样性及其脱氮的微生物学机理,为工艺改进提供依据,从同步高效去除垃圾渗滤液中高氨氮和高COD的SBBR生物膜和渗滤液原水中采集微生物样品并提取微生物总DNA,使用细菌通用引物对(GC341F/907R)从总DNA中成功扩增出目标16S rDNA片段,然后对扩增的16S rDNA进行DGGE,对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序,使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树.结果表明,该驯化后的SBBR生物膜和渗滤液原水中都有比较丰富的细菌多样性,驯化的生物膜细菌主要来自渗滤液原水,而且生物膜细菌在反应器正常运行时不会出现明显的群落结构变化;在该SBBR中有多种硝化细菌与反硝化细菌、好氧反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共存,说明该反应器中可能同时存在全程硝化反硝化、同步硝化反硝化和厌氧氨氧化3种脱氮方式.研究结果为SBBR脱氮微生物机理研究提供了一些有价值的参考依据.

基于PCR-DGGE技术分析生物絮团的细菌群落结构

在草鱼养殖过程中添加碳源(葡萄糖)维持水体C∶N为20∶1以培养生物絮团,通过对生物絮团细菌群落构成进行种类鉴定来评价生物絮团中功能微生物的组成。采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术分析生物絮团形成第5、10和15天的细菌群落结构。DGGE指纹图谱结果分析表明:第5天和第10天的相似性最高,达67.4%;第5天和第15天相似性系数最低仅为40.5%。第10天时微生物多样性最高,第15天时多样性最低。对DGGE指纹图谱特征条带进行回收、克隆测序,结果表明,生物絮团培养过程主要微生物类群隶属于以下6个纲:α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌纲(Bacteroidetes),其中α-、β-及γ-变形菌占据主要位置。α-proteobacteria为3个阶段的共有优势菌,第5天时特异菌包括食酸菌属(Acidovorax)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium),第10天和15天分别为芽孢杆菌属(Bacillus)与红球菌属(Rhodococcus)。研究首次发现,生物絮团应用于淡水养殖系统时细菌的组成和多样性都极其丰富,通过结合分析这些微生物的功能特点,为生物絮团技术在实际养殖生产中的进一步应用奠定基础。

利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性

本文旨在采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性。选用15羽28日龄肉鸡,按2mL/kgBW喂服枯草芽孢杆菌悬液(109CFU/mL),每天2次,连续3d,34日龄时,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法分析肠道菌群的多样性,并对DGGE条带进行回收、测序。结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P<0.05或P<0.01),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为53.2%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;回收条带以乳杆菌属细菌为主。结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PCR-DGGE检测方法明显优于ERIC-PCR。

刺参消化道内含物细菌群落组成的PCR-DGGE分析

利用PCR-DGGE技术研究刺参(Apostichopus japonicus)前肠、中肠和后肠内含物的细菌群落组成。通过软件Bio-rad Quantity one分析DGGE指纹图谱,发现刺参后肠内含物的条带数目显著高于前肠和中肠(P=0.003,P=0.016),表明刺参后肠内含物的细菌多样性最高,其次是中肠;前肠内含物的细菌多样性最低。UPGMA聚类分析发现,不同刺参个体其后肠的细菌群落组成差异最小,前肠的细菌群落差异最大。经DGGE分离、条带切割和序列测定,共获得了13条序列,系统发育分析表明,刺参消化道内含物的细菌群落可主要归属于5大类群,即α-变形菌纲(α-proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)。刺参前肠、中肠和后肠内含物的优势菌群均为γ-proteobacteria。Blast分析显示,其中12条与之亲缘关系最近的序列来自从海洋环境中获得的细菌克隆,表明刺参消化道的细菌群落可能直接或间接来源于刺参的栖息地环境。

三种室内饲养鱼类肠道微生物群落PCR-DGGE指纹分析

以室内饲养的斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、银鲫和异育银鲫(中科三号)(Carassius auratus gibelio)幼鱼为对象,通过PCR-DGGE指纹技术对其肠道微生物群落进行了探索研究。在三种鱼的肠道中检测到不同的PCR-DGGE指纹谱带,其中斑点叉尾的平均谱带数(7.5)相对于银鲫和异育银鲫的谱带数(分别为15和14)要少。基于PCR-DGGE指纹谱带及各谱带相对丰度的UPGMA聚类和MDS排序结果显示银鲫和异育银鲫肠道微生物相似性高,而与斑点叉尾的差异比较大;rank-abundance散点图及回归分析也显示斑点叉尾与银鲫、异育银鲫肠道微生物群落存在显著差异(P<0.05),而银鲫和异育银鲫之间无显著差异(P=0.383)。在斑点叉尾肠道中检测到的菌群主要是变形杆菌,包括γ-变形杆菌和α-变形杆菌;而银鲫和异育银鲫肠道中菌群主要包括梭杆菌属中的类群,还包括变形杆菌门中的气单胞菌属,以及一些未知的类群。以上结果均表明在所研究的三种鱼的幼鱼阶段,其肠道微生物组成在不同种类鱼中存在差异,且该差异受基因型的影响可能更大。

PCR-DGGE法用于活性污泥系统中微生物群落结构变化的解析

应用PCR- DGGE方法,对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。研究结果表明:由于工艺和操作条件相同,两系统的微生物群落结构的相似性随着运行时间的增加而增加。PCR-

基于PCR-DGGE技术的剑湖湿地湖滨带土壤微生物群落结构多样性分析

为了解剑湖湿地湖滨带植物根际土壤中细菌的群落结构特征多样性,应用PCR-DGGE技术对剑湖湿地湖滨带4种植物根际土壤细菌的群落结构进行了研究,根据DGGE指纹图谱,对它们的遗传多样性进行了分析。结果表明,不同植物群落根际和非根际土壤细菌多样性指数(H′)、丰度(S)和均匀度(J)均有所不同,根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均高于非根际,其中茭草根际土壤细菌多样性指数、均匀度、丰富度均最高,说明植物群落类型与土壤微生物多样性的关系十分密切;不同植物群落根际土壤细菌群落结构相似性较高,非根际土壤细菌群落结构相似性较低,在82%的相似水平上聚为4大类群,根际土壤细菌和茭草非根际土壤细菌聚为一类,其余非根际土壤细菌各聚为一类,说明植物群落对微生物群落结构具有一定的影响。对DGGE的优势条带序列分析,同源性最高的微生物分别属于变形菌门(Proteobacteria)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、紫色杆菌属(Janthinobacte rium)、杜擀氏菌属(Duganella)、埃希氏菌属(Escherichia)和链球菌属(Streptococcus),它们均为未培养微生物。不同植物群落根际土壤氮磷含量均有所差异,其中茭草根际土壤氮磷含量最高,湿地土壤细菌多样性与土壤有机质、总N、总P的含量呈正相关关系,土壤细菌多样性与土壤pH值呈负相关关系。

生物炭对农田土壤细菌群落多样性影响的PCR-DGGE分析

为评价生物炭对农田土壤细菌群落多样性的影响,对不同施肥方式农田土壤细菌总DNA进行提取和16S rDNA特异性扩增,运用变性梯度凝胶电泳DGGE的分子生物学技术,对施肥土壤细菌群落的多样性进行表征。DGGE电泳结果表明,不同处理均可得到20条以上的电泳条带,说明水稻土土壤细菌群落较丰富。从泳道条带数量及光密度值方面对细菌群落多样性指标比较发现,施加生物炭的土壤(T2、T3、T4)细菌丰富度最高,细菌种群较多,其次为秸秆还田处理土壤(T1),而空白对照处理土壤(CK1)细菌群落丰富度最低,各处理之间的细菌种群均匀度指数差异不显著;对细菌群落的条带信息与土壤理化性质进行相关性分析得到,细菌群落的结构变化与各土壤理化性质的相关性大小依次为速效钾>总有机碳>有效磷>全氮>pH。

在PCR-DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应

应用普通细胞裂解法提取 3株实验菌株 (Escherichia coli DH5α,Staphylococcus aureus SA- 1和 A-grobacterium tumerfaciens 1 31 2 9)的基因组 DNA和应用基于高盐和长时高热的细胞裂解法提取 7种不同土壤样品中的微生物的基因组 DNA,两组不同结构的引物 F3 57GC,R51 8(在正向引物的 5′端有 GC发卡结构 )和 F3 57,R51 8,分别对实验菌株和土壤样品中微生物的 1 6Sr RNA基因 V3区进行扩增 ,均得到了目的片段。比较了不同引物扩增的 1 6S r DNA片段在 DGGE中的不同电泳行为 ,结果表明 ,含 GC发卡结构的PCR扩增产物在 DGGE中能够得到很好的分离 ,而无 GC发卡结构的 PCR产物则不能在 DGGE中获得满意分离。引入 GC发卡结构 。

PCR-DGGE分析啤酒废水生物处理工艺的微生物区系

应用基于16S rDNA的PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术对啤酒废水'水解酸化+SBR'工艺的微生物多样性进行研究.分别取水解酸化池与SBR池中不同深度以及不同处理时段的活性污泥,提取样品总DNA,通过PCR扩增、变性梯度凝胶电泳,将16SrDNA(V3区)的PCR扩增片段割胶克隆测序确定样品中的微生物群落,与筛选出的高效菌株进行对比分析.结果表明,水解酸化池中的微生物群落随深度的改变,在结构组成和种群数量上均有较大差异,2m深处微生物群落相对丰富,优势条带突出;SBR池不同深度微生物种群结构一致,沉淀期、进水期和曝气期不同处理时段的微生物种类一致,但优势菌群不同;所测序列y2、23、25、31、h5和15号分别与菌株uncultured Thermotogales sp.、Comamonas sp.WTOTU1、Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis、Bdellovibrio bacteriovorus、Comamonas testosteroni有高度同源性,活性污泥样品中的优势条带与高效菌株的序列不同,表明筛选出的高效菌并非为实际处理过程中的优势菌.

用PCR-DGGE研究长期施用无机肥对种稻红壤微生物群落多样性的影响

以中国科学院红壤生态试验站的发育于第四纪红粘土的种稻红壤为研究对象，采用PCR-DGGE方法研究了长期施用无机肥对土壤微生物群落多样性的影响。在种植双季稻、连续13a施用不同无机肥后，土壤中细菌、古菌、放线菌和真菌的群落结构发生了较大的变化。未种植水稻的土壤与种稻土壤间四类微生物SSUrDNADGGE带谱相似性只有33％～66％。施磷肥的处理NP、PK、NPK之间微生物群落结构相似性较高，4类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性高达75％～81％。施氮钾肥（NK）、不施肥（CK）处理与施磷肥处理间土壤微生物群落结构的差异较大，其四类微生物的SSUrDNADGGE带谱相似性分别为69％～77％、55％～77％。研究的目的是深入地了解土壤中微生物群落的多样性，为科学施肥、合理利用土壤、保护微生物多样性和实现农业生态系统的可持续发展提供科学依据。

PCR-DGGE对长江河口八种野生鱼类肠道菌群多样性的比较研究

目的分析长江河口捕获的8种野生鱼类的肠道菌群多样性的差异并观察这种差异与食性的联系。方法采用PCR-DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)技术,DGGE图谱用PCA(principal component analy-sis)方法进行分析。结果建立了长江口8种鱼野生条件下肠道菌群的DGGE指纹图谱,观察到它们在野生条件下的肠道菌群的差异。其中,营底栖生活的舌鰕虎鱼的肠道菌群和其他7种野生鱼有着明显的差异,其他7种鱼的肠道菌群多样性的差异与它们的食性差异相关。结论PCR-DGGE技术是一种能够快速有效地分析研究鱼类肠道菌群结构的技术。8种野生鱼的肠道菌群的结构有明显的差别。

PCR-DGGE技术在城市污水化学生物絮凝处理中的特点

通过PCR DGGE等分子生物学技术可以不经过常规培养直接从活性污泥和生物膜样品中提取DNA ,对 16SrDNAV3区进行PCR扩增 ,结合DGGE(变性梯度凝胶电泳 ) ,从而分析活性污泥与生物膜中微生物种群结构 .研究证实 ,活性污泥培养前后微生物种群结构发生很大的改变 .同时对 2种污水处理工艺中微生物种群结构进行了对比研究 ,对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨 .测定了活性污泥中部分菌种的 16SrDNAV3区片段序列 ,通过NCBI(美国国立生物技术信息中心 )基因库比对 ,初步确定细菌的属 .结果显示 ,PCR

应用PCR-DGGE技术分析黄海冷水团海域的细菌群落组成

利用PCR-DGGE技术对2个季节（2006-04和2006-10）的黄海冷水团海域的细菌群落组成和优势菌群进行了分析.通过软件Glyko Bandscan分析DGGE图谱,4月份所有站位的条带数相近（约17条）,多样性丰富;10月份,在冷水团范围以内站位的条带约16条,其多样性也较丰富;而在冷水团范围以外站位的条带少（约12条）,其多样性较低.细菌16S rDNA V3区特征片段经DGGE分离、条带切割,共得到24条条带,克隆、测序后,进行系统进化分析,结果显示这24条带分别归属于2个细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroides）.在24条序列中有16条分别与变形细菌亚群的γ-和δ-Proteobacteria相似,有5条与拟杆菌门相似.时空分析发现,4月份所有站位水体（海水温度为7-12℃）的细菌群落组成和10月份（冷水团存在期）冷水团内部水体（海水温度低于10℃）的细菌群落组成相同（都包括γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Bacteroides）,与10月份冷水团外部水体（海水温度大于19℃）的（包括γ-Proteobacteria和Bacteroides）不同.优势菌群也存在同样的分布特点,4月份所有站位水体的优势菌群与10月份冷水团内部水体的优势菌群也相同（都是γ-Proteobacteria）,而10月份冷水团外部水体不同的站位优势菌群不同.该海域细菌群落组成和优势菌群的分布特点,可能与冷水团的形成有一定的相关性.