柴胡皂苷A调节cAMP/PKA/CREB信号通路对失眠大鼠的改善作用及机制研究

目的基于cAMP/PKA/CREB通路探讨柴胡皂苷A对失眠大鼠的改善作用及机制。方法将75只SD大鼠随机分为空白组、模型组、柴胡皂苷A低剂量组(0.625 mg·kg^(-1))、柴胡皂苷A高剂量组(2.500 mg·kg^(-1))、艾司唑仑组(0.1 mg·kg^(-1)),每组15只。采用腹腔注射苯丙氨酸(PCPA,0.1 mg·kg^(-1))复制失眠大鼠模型。观察大鼠一般情况及昼夜节律;采用戊巴比妥钠翻正实验测定大鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间;观测大鼠睡眠时相,记录慢波睡眠第1期(SWS1)、慢波睡眠第2期(SWS2)、快速眼球运动睡眠期(REMS)时长以及总睡眠时长(TST);qRT-PCR法测定下丘脑节律基因Clock、Bmal1 mRNA及钟控基因Rev-erbα、RorαmRNA的表达水平;免疫荧光法测定海马组织NeuN表达水平;ELISA法测定脑组织中的cAMP水平;Western Blot法测定脑组织中Clock、Bmal1、Rev-erbα、Rorα及cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠昼伏夜出的节律紊乱,极度兴奋,易激惹,睡眠减少;睡眠潜伏期明显延长(P<0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显缩短(P<0.05);神经元排列紊乱,NeuN阳性神经元IOD值明显降低(P<0.05);脑组织Clock、Bmal1、Rev-erbα、RorαmRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,给药组大鼠的攻击性明显减弱,昼伏夜出有节律性,活动减少,睡眠增多;睡眠潜伏期明显缩短(P<0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显延长(P<0.05);神经元排列紊乱情况有所恢复,NeuN阳性神经元IOD值明显升高(P<0.05);脑组织Clock、Bmal1、Rev-erbα、RorαmRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论柴胡皂苷A可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路改善失眠大鼠的昼夜节律。

黄芩苷对干酵母致热大鼠的解热作用及血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)、cAMP和脑组织NF-κB表达的影响

目的:观察黄芩苷对干酵母致热大鼠的解热作用并探讨其作用机制。方法:采用背部皮下注射干酵母构建大鼠发热模型,SD雄性大鼠随机分为正常对照,模型组,阳性组(阿司匹林,0.1 g/kg),黄芩苷高、中、低剂量组(160、80、40 mg/kg),连续给药3 d,测定各组大鼠肛温的变化;酶联免疫法(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素E_(2)(PGE_(2))与环磷酸腺苷(cAMP)水平;Western Blot检测各组大鼠脑组织NF-κB p65(核转录因子-κB p65)蛋白表达。结果:黄芩苷高剂量组有显著解热效果(P<0.01),黄芩苷各剂量组均可不同程度降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE 2和cAMP含量;与正常组比较,模型组脑组织NF-κB p65蛋白表达增多,黄芩苷高剂量组可明显降低大鼠脑组织NF-κB p65表达(P<0.05)。结论:黄芩苷可显著性降低干酵母引起的体温升高,解热机制可能与抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE_(2)与cAMP的分泌和减少脑组织NF-κB p65蛋白表达有关。

麦冬皂苷D调节cAMP/PKA/CREB信号通路对炎症性肠病大鼠炎性损伤的影响

目的:探究麦冬皂苷D调节cAMP/PKA/CREB信号通路对炎症性肠病(IBD)大鼠炎性损伤的影响。方法:将大鼠分为对照组、模型组、麦冬皂苷D低剂量组、麦冬皂苷D高剂量组和麦冬皂苷D高剂量+H-89(cAMP抑制剂)组。检测大鼠质量和大鼠结肠长度;酶联免疫吸附法检测血清IL-17、IL-6、IL-10、TNF-α、cAMP水平;流式细胞术检测大鼠外周血中Th17、Treg细胞比例;HE染色检测结肠组织病理损伤;Western blot检测大鼠结肠组织中Bax、Bcl-2以及cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果:治疗结束后,与对照组相比,模型组大鼠结肠组织显著损伤,体质量、结肠长度、血清IL-10、cAMP水平、外周血Treg细胞比例、结肠组织Bcl-2、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达显著降低,血清IL-17、IL-6、TNF-α水平、外周血中Th17比例和Th17/Treg比值、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组相比,麦冬皂苷D低、高剂量组大鼠结肠组织显著减轻,体质量、结肠长度、血清IL-10、cAMP水平、外周血Treg细胞比例、结肠组织Bcl-2、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达显著升高,血清IL-17、IL-6、TNF-α水平、外周血中Th17比例和Th17/Treg比值、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05);H-89可部分逆转麦冬皂苷D对炎症性肠病大鼠的治疗作用(P<0.05)。结论:麦冬皂苷D可降低IBD大鼠炎症反应和结肠组织损伤,可能是通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路实现的。

基于PACAP-cAMP-PKA信号通路探讨J型针刀调节神经源性膀胱逼尿肌的效应机制

目的:探讨J型针刀通过PACAP-cAMP-PKA信号通路改善脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠逼尿肌的作用机制。方法:36只SD雄性大鼠随机分为6组:空白组、假手术组、模型组、J型针刀治疗组、治疗+Bupivacaine抑制剂组、治疗+H-89抑制剂组,各6只。采用脊髓横断法制作神经源性膀胱模型。空白组为正常SD大鼠;假手术组为切开相关部位组织,无脊髓切断;其余4组予以手术脊髓切断造模。J型针刀治疗组造模后第19天予J型针刀针刺大鼠次髎穴,2 d 1次,共治疗7次。干预结束后各组行HE染色观察膀胱逼尿肌组织形态变化,Elisa检测膀胱逼尿肌组织中c AMP、PKA含量,免疫组化检测膀胱逼尿肌组织中PACAP38蛋白表达,Western blot检测膀胱逼尿肌组织中PKA、p-MLC蛋白表达。结果:HE染色结果显示,与空白组相比,模型组中膀胱逼尿肌组织严重坏死,可见大量炎症细胞浸润;与模型组相比,J型针刀治疗组、治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组均有不同程度坏死组织修复情况。免疫组化检测PACAP38蛋白表达在模型组中表达量最低,针刀治疗之后,PACAP38表达量均不同程度上调;与J型针刀治疗组相比,治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组PACAP38蛋白表达均不同程度下调(P<0.05),但高于模型组(P<0.05)。Elisa检测结果显示,cAMP、PKA表达量模型组显著下调(P<0.05),J型针刀治疗组与模型组比显著上调(P<0.05),治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组比无显著差异(P>0.05)。WB结果显示:与空白组相比,模型组PKA、p-MLC蛋白表达上调;针刀治疗组表达量下调,其中PKA蛋白表达有显著性(P<0.05),p-MLC蛋白表达无显著性(P>0.05)。与J型针刀治疗组比,PKA蛋白表达量在治疗+Bupivacaine抑制剂组及治疗+H-89抑制剂组中无显著差异(P>0.05),p-MLC蛋白表达量显著下降(P<0.05)。结论:J型针刀针刺次髎穴可改善脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠膀胱功能,其机制与J型针刀上调膀胱逼尿肌中PACAP38、cAMP、PKA表达,激活PACAP-cAMP-PKA信号通路,从而促进逼尿肌舒张有关。

参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及cAMP/PKA信号通路和TRPV1蛋白表达的影响

目的探讨参榆洗液对痔术后大鼠痛觉敏化及环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信号通路、香草酸瞬时受体亚型1(TRPV1)蛋白表达的影响。方法取40只雄性SD大鼠,随机选择其中8只作为空白组,其余大鼠采用冰醋酸建立痔术后创面模型。将造模成功大鼠随机分为模型组及参榆洗液低、中、高剂量组,每组8只。自成功造模后的第1天开始,模型组给予高压灭菌水局部熏洗,参榆洗液低、中、高剂量组分别予以参榆洗液0.4 g生药/mL、0.8 g生药/mL、1.6 g生药/mL局部熏洗,均2次/d,每次15 min,2次治疗间隔12 h,连续7 d。记录大鼠第1,4,7天换药刺激后3 min内首次舔舐肛周创面潜伏时间、扭体反应次数以及舔舐肛周创面总时间,观察造模后和干预3,5,7 d后创面情况并记录创面愈合率,HE染色观察干预7 d后创面组织病理学形态,Western blot法检测干预7 d后创面组织中cAMP、PKA蛋白和背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白表达情况。结果与空白组比较,模型组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显缩短(P<0.05),扭体反应次数明显增加(P<0.05),舔舐肛周创面总时间明显延长(P<0.05);创面组织中有大量中性粒细胞与淋巴细胞浸润,组织水肿明显;创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与模型组比较,参榆洗液中、高剂量组大鼠首次舔舐肛周创面潜伏时间明显延长(P均<0.05),扭体反应次数明显减少(P均<0.05),舔舐肛周创面总时间明显缩短(P均<0.05);参榆洗液各组干预5,7 d后创面愈合率更高(P均<0.05);参榆洗液各组大鼠创面组织中中性粒细胞、淋巴细胞浸润减少,成纤维细胞、新生血管增多;参榆洗液各组创面组织中cAMP、PKA蛋白相对表达量及背根神经节中TRPV1、p-PKA蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),且呈剂量依赖性下降(P均<0.05)。结论参榆洗液可呈剂量依赖性改善痔术后大鼠痛觉敏化,促进创面愈合,机制可能与下调cAMP/PKA信号通路相关蛋白及TRPV1蛋白表达有关。

中医药从“阴阳失调”理论调控cAMP/PKA信号通路治疗注意缺陷多动障碍的研究进展

注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)难控制、易反复,严重损害儿童运动、情绪及学习生活。ADHD发病机制不明,涉及神经递质传递、神经炎症及氧化应激等,病机本质责之于“阴阳失调”。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号通路的激活可诱导一系列蛋白底物磷酸化而参与运动及学习记忆的形成,并能促进神经递质合成,抑制促炎因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的释放而改善ADHD的核心症状,且该通路失调所导致的能量代谢障碍、神经冲动传递异常与中医“阴阳失调”理论不谋而合。中医药通过干预cAMP/PKA信号通路恢复阴阳平衡对儿童ADHD的防治发挥了重要作用,并有效解决了精神类药品在儿童中使用受限的问题。基于ADHD中医药研究的日益增多,本文阐述了cAMP/PKA信号通路的结构、传导及其与ADHD机制、中医病机及辨证分型的关系,归纳了中药复方、单体及单味中药干预cAMP/PKA信号通路治疗ADHD的研究现状,旨在为ADHD的中药药理学研究提供依据,丰富ADHD“阴阳失调”的中医理论内涵,为ADHD的防治提供新见解、新方向。

基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨固本止咳方治疗慢性阻塞性肺疾病稳定期小鼠的作用机制

目的基于环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路探讨固本止咳方(GBZK)治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)稳定期小鼠的作用机制。方法60只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组、GBZK组、地塞米松组,除对照组外,其余组均使用烟草烟雾暴露联合脂多糖复制COPD稳定期小鼠模型。造模成功后,GBZK组予GBZK 0.2 mL/d灌胃,地塞米松组予1.0 mg/kg地塞米松注射液腹腔注射,2次/d,所有小鼠均给药28 d。观察各组小鼠一般情况,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠肺组织匀浆cAMP水平,利用Western blot检测小鼠肺组织匀浆中cAMP、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达情况。结果与模型组比较,GBZK组小鼠的喘息气促有所改善,肺组织匀浆中cAMP含量及cAMP、p-PKA、CREB、p-CREB蛋白表达均提高(P<0.05)。结论固本止咳方可能通过激活cAMP/PKA/CREB信号通路,进而发挥对COPD稳定期小鼠的保护作用。

cAMP抑制核盘菌菌核形成的差异基因表达分析

【目的】探究核盘菌响应环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)处理的转录组学特征,挖掘调控核盘菌菌核形成的关键基因,为靶向杀菌剂的研发提供参考。【方法】以接种在PDA培养基上生长至菌核原基形成时期的核盘菌作为CK1,开始形成黑色素时期的核盘菌作为CK2,以接种在PDA+5 mmol/L cAMP培养基上生长相同时间(5,7 d)的核盘菌作为试验组,依次命名为M1和M2,对这4组样品进行转录组测序(RNA-seq)比较,阐释cAMP影响菌核形成的调控途径,挖掘菌核原基及菌核黑色素形成中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。【结果】外源添加的cAMP主要在M1前期影响胞内的cAMP含量。差异表达基因分析结果显示,M1和CK1之间共有681个差异表达基因;KEGG富集分析显示,这些基因主要参与各类氨基酸代谢、脂肪酸代谢、MAPK信号通路等,且通路中的大部分基因都呈上调表达模式,而MAPK及其下游作用因子钙调磷酸酶B亚基(calcineurin B subunit,CnB)和热休克蛋白70(heat shock 70 ku protein,HSP70)则明显下调。M2和CK2之间共筛选到4490个差异表达基因,主要参与各类氨基酸代谢、抗原加工提呈以及cAMP、MAPK等信号通路和自噬途径,通路中的大部分基因呈上调表达模式,且自噬相关因子ATG2、ATG20、ATG22、ATG23、ATG27和ATG29也大量上调表达,而与蛋白质和脂类合成相关的磷酸酶B(phosphatase B,PTPB)和酰基辅酶A氧化酶(acyl coenzyme A oxidase,ACO)的表达量则明显下调。在M1和M2时期,相关基因的qRT-PCR与RNA-seq差异表达分析结果趋势相同,说明转录组测序数据准确。【结论】核盘菌可通过吸收胞外高浓度的cAMP抑制菌核形成菌丝,其抑制作用主要通过影响相关蛋白质及脂类物质的合成而对菌丝形态及信号传递造成障碍。

补阳还五汤通过cAMP/PKA/PPARγ通路调控脂质代谢抗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用

目的探究补阳还五汤通过cAMP/PKA/PPARγ通路调控脂质代谢抗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机理。方法将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、丁苯酞组及补阳还五汤低、中、高剂量组。采用短暂性大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型,补阳还五汤低、中、高剂量组予不同剂量补阳还五汤灌胃(6.413、12.825、25.65 g·kg^(-1)),丁苯酞(NBP)组予丁苯酞灌胃(54 mg·kg^(-1)),假手术组和模型组予等体积蒸馏水灌胃,连续14 d。对大鼠进行神经行为学评分,HE染色观察大脑病理变化,试剂盒检测缺血侧磷酸胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、游离脂肪酸(FFA)含量,RT-qPCR和WesternBlot法检测环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)中mRNA及蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能缺损评分明显升高(P<0.01);缺血侧皮质出现病理形态损伤;PC、PE含量降低,DAG、FFA含量升高(P<0.01);cAMP的mRNA升高(P<0.05)。与模型组比较,补阳还五汤低剂量组神经功能缺损评分降低(P<0.05),补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组神经功能缺损评分明显降低(P<0.01);各给药组细胞排列相对规整,细胞间隙减小,正常细胞增多;补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组PC、PE明显升高,DAG、FFA明显降低(P<0.01);补阳还五汤低剂量组PC升高,FFA、DAG明显降低(P<0.05,P<0.01);补阳还五汤低剂量组PPARγ的mRNA表达升高(P<0.05),补阳还五汤中、高剂量组和丁苯酞组cAMP、PKA、PPARγ的mRNA及蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤大鼠具有神经保护作用,其机制可能与调控cAMP/PKA/PPARγ信号通路关键因子的表达,调节脂质代谢有关。

影响枣果肉离体愈伤组织cAMP含量的因素

环磷酸腺苷(cAMP)具有第二信使功能及重要的药用价值,但含量通常极低,通过组织培养快速繁殖富含cAMP的植物材料用于提取cAMP前景广阔。枣树原产于我国,其成熟果肉中富含cAMP。为探明利用枣果肉愈伤组织生产cAMP的可行性,研究了基因型和果实成熟度对果肉愈伤组织cAMP含量的影响以及培养基类型、继代次数和cAMP合成关键酶腺苷酸环化酶(AC)的辅离子等对果肉愈伤组织cAMP含量的调控作用。选取不同枣果实以及相对应的不同基因型的枣果肉愈伤组织、不同培养基上的果肉愈伤组织、不同发育阶段及不同继代次数的果肉愈伤组织、经AC辅离子处理过的果肉愈伤组织,利用ELISA试剂盒测定其cAMP含量。结果表明,幼果期果肉愈伤组织中cAMP含量高于其幼果期果实中的cAMP含量,不同基因型果肉愈伤组织中cAMP含量存在差异,但远小于不同基因型果肉中cAMP含量的差异。幼果期的果肉最容易形成愈伤组织,随着果实成熟度的增加越来越难以诱导出愈伤组织,而不同发育阶段果实诱导产生的愈伤组织中cAMP含量的差异不大,远小于不同发育阶段果肉中cAMP含量的差异。培养基类型不仅影响愈伤组织的形成,还显著影响果肉愈伤组织中cAMP的含量;继代10次的果肉愈伤组织cAMP含量低于继代5次的。培养基中添加不同浓度及不同处理时间段的AC辅离子(MgCl_(2)、Mn Cl_(2)、CaCl_(2))对果肉愈伤组织中cAMP含量有一定的影响,100μmol/L MnCl_(2)处理48 h可显著提高幼果期果肉愈伤组织的cAMP含量,100μmol/L CaCl_(2)处理48 h可显著提高小紫枣和酸枣2X半红期果肉愈伤组织的cAMP含量,100μmol/L MgCl_(2)处理48 h可显著提高稷山板枣半红期果肉愈伤组织的cAMP含量。枣果肉愈伤组织基因型、果实成熟度、培养基类型、继代次数、AC辅离子对枣果肉愈伤组织中cAMP含量有着一定的影响。因此,利用枣果肉愈伤组织培养生产cAMP时,应重点优化愈伤组织培养环境。本研究为以后通过组织培养生产cAMP及开展果实cAMP含量调控研究提供了重要理论参考。

人参-五味子药对对PCPA失眠大鼠神经递质及cAMP/Epac/Raf1信号通路的作用机制研究

目的通过观察人参-五味子药对对失眠大鼠下丘脑中神经递质及其cAMP/Epac/Raf1信号通路水平的影响,探讨人参-五味子药对对PCPA失眠大鼠的作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、地西泮组、人参-五味子低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组10只。除空白组外,其余5组连续3 d对大鼠进行腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)复制失眠模型。模型复制成功后,人参-五味子药对低、中、高剂量组给药浓度分别为0.3、0.9、2.7 g/mL,地西泮组给药浓度为0.002 g/mL,模型组、空白组每天生理盐水灌胃,各组每日灌胃2 mL,连续给药14 d。观察记录各组大鼠的行为学变化;采用HE(苏木素-伊红)染色法检测大鼠下丘脑组织病理形态的改变;ELISA(酶联免疫吸附法)测定大鼠下丘脑中甘丙肽(GAL)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、腺苷(Ado)水平;RT-PCR(实时荧光定量聚合酶链式反应)检测大鼠下丘脑中Eapc、Raf1mRNA的表达;IHC(免疫组织化学染色法)检测大鼠下丘脑中cAMP蛋白的含量。结果和空白组相比:模型组大鼠下丘脑病理切片损伤明显;GAL、5-HT、Ado含量显著下降(P<0.05),NE含量显著上升(P<0.05),下丘脑Eapc、Raf1 mRNA表达显著下降(P<0.05),下丘脑cAMP蛋白表达显著下降(P<0.05),差异有统计学意义。与模型组相比:地西泮组、人参-五味子低、中、高剂量组下丘脑病理切片损伤明显改善;地西泮组、人参-五味子中、高剂量组GAL、5-HT、Ado含量显著上升(P<0.05),NE含量显著下降(P<0.05),下丘脑Eapc、Raf1 mRNA表达显著上升(P<0.05),下丘脑cAMP蛋白表达显著上升(P<0.05),差异有统计学意义。结论人参-五味子药对可能通过上调cAMP/Epac/Raf1信号通路,缓解PCPA大鼠失眠症状。

基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨柴胡皂苷对多发性抽动症小鼠的治疗作用

目的基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应成分结合蛋白(cAMP/PKA/CREB)信号通路探讨柴胡皂苷(SS)对多发性抽动症(TS)模型小鼠的治疗作用。方法将小鼠随机分为对照组、TS组、SS低剂量(SS-L)组、SS高剂量(SS-H)组、阳性药物组、SS-H+PKA抑制剂(H-89)组,每组10只。除对照组外,其他各组经腹腔注射亚氨基二丙腈溶液建立TS小鼠模型。造模后,SS-L组、SS-H组分别给予25、100 mg/kg SS腹腔注射,并以生理盐水灌胃;阳性药物组以0.5 mg/kg氟哌啶醇灌胃,并以生理盐水腹腔注射;SS-H+H-89组以100 mg/kg SS、5 mg/kg H-89腹腔注射,并以生理盐水灌胃;TS组及对照组分别以等体积的生理盐水腹腔注射、灌胃。每天1次,连续干预3周。对小鼠运动行为、刻板行为进行评分,用ELISA法检测纹状体组织中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)以及多巴胺(DA),用苏木精-伊红法观察脑组织形态学变化,用免疫组化法检测黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元,用Western blotting法检测cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,TS组脑细胞形态被破坏,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量高(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达低(P均<0.05);与TS组比较,SS-L组、SS-H组、阳性对照组脑细胞形态得到改善,干预1、2、3周小鼠运动行为评分、刻板行为评分及纹状体组织中NE、DA水平、TH阳性神经元数量低(P均<0.05),纹状体组织中5-HT水平及cAMP、PKA、CREB蛋白表达高(P均<0.05);S-H+H-89组逆转SS-H组各指标的变化(P均<0.05)。结论SS可能通过调节cAMP/PKA/CREB信号通路对TS小鼠发挥治疗作用。

参榆洗液改善痔术后大鼠痛觉敏化及对cAMP/PKA信号通路的影响

目的:基于环磷酸腺苷/蛋白激酶A(c AMP/PKA)信号通路探究参榆洗液对痔术后大鼠疼痛的影响。方法:构建痔术后大鼠模型,将造模成功的56只SD大鼠随机分为模型组、溶剂模型组、参榆洗液组、参榆洗液+Forskolin(c AMP/PKA信号通路激动剂)组、Forskolin组、H-89(c AMP/PKA信号通路抑制剂)组、NS-398(PGE_(2)抑制剂)组,每组8只;另取8只大鼠为空白组。各组大鼠给予对应药物干预,连续7 d。给药结束后1 d,观察大鼠一般状态及疼痛相关动物学行为,观察创面变化并计算创面愈合率,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠创面组织病理学改变,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测各组大鼠背根神经节TRPV1、p-PKA蛋白表达及创面组织中c AMP、PKA蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠创面组织中c AMP m RNA、PKA m RNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测创面组织中PGE_(2)、IL-6、IL-1β含量。结果:模型组大鼠背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面周围组织c AMP、PKA、PGE_(2)、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、IL-1β表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,H-89组、NS-398组、参榆洗液+Forskolin组、参榆洗液组创面组织病变程度减轻,创面愈合率依次上升,背根神经节组织中p-PKA、TRPV1及创面组织c AMP、PKA、c AMP m RNA、PKA m RNA、IL-6、PGE_(2)、IL-1β表达水平依次降低(P<0.05);Forskolin干预能显著提高痔术后大鼠模型c AMP、PKA、TRPV1、p-PKA、PGE_(2)、IL-6、IL-1β表达水平(P<0.05),与参榆洗液联合干预后,上述蛋白及炎症因子表达水平显著下降(P<0.05)。结论:参榆洗液对痔术后大鼠cAMP/PKA信号通路有抑制作用,抑制c AMP/PKA信号通路可改善痔术后痛觉敏化,其机制可能与抑制PGE_(2)表达、减少炎症因子释放、抑制TRPV1活化有关。

丁香酚通过激活cAMP抑制3T3⁃L1前脂肪细胞分化

为研究丁香酚对3T3⁃L1前脂肪细胞成脂分化过程的影响及其分子机制,以未分化的3T3⁃L1前脂肪细胞为对照组,3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和罗格列酮诱导分化的成熟脂肪细胞为模型组,探究3T3⁃L1细胞分化过程中的丁香酚处理对脂质积累的影响;使用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536处理细胞,探究环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)在丁香酚抑制脂质积累中发挥的关键作用。结果表明,与模型组相比,50µmol/L丁香酚处理显著降低脂质含量(P<0.0001),显著升高胞内cAMP水平(P<0.01)。当培养基中存在SQ22536时,丁香酚对3T3⁃L1细胞成脂分化过程中脂质积累的抑制作用由24.7%被削弱至6.7%,而丁香酚对细胞内cAMP水平的促进效果被完全消除。实时荧光定量聚合酶链式反应分析结果表明,丁香酚显著下调3T3⁃L1细胞成脂分化过程中脂质生成基因CEBPα(P<0.05)和aP2(P<0.01)的表达,显著上调产热相关基因UCP1的表达(P<0.01);SQ22536处理削弱或完全消除丁香酚对3T3⁃L1细胞脂质积累的抑制作用。因此,丁香酚可有效抑制3T3⁃L1细胞脂质积累,其作用机制与cAMP的激活有关。

针刺足三里对CFA大鼠尾壳核中A1R/cAMP/p-CREB信号通路的影响

目的:观察针刺对完全弗氏佐剂(CFA)大鼠尾壳核(CPu)中的腺苷A1受体(A1R)/环磷酸腺苷(cAMP)/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)信号通路的影响,探讨针刺治疗炎性痛的潜在机制。方法:将64只6~8周龄雄性Wistar大鼠运用随机数字法随机分为盐水组、模型组(CFA组)、CFA+手针针刺(MA)组、CFA+溶剂二甲基亚砜(DMSO)组、CFA+A1R激动剂2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)组、CFA+A1R拮抗剂8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤(DPCPX)组、CFA+MA+DMSO组和CFA+MA+DPCPX组,每组8只。采用右侧足底皮内注射CFA制作关节炎炎性痛模型。针刺组于造模后第2天针刺大鼠双侧足三里穴,每次30 min,每天1次,共7 d。采用足底热辐射痛阈值评判大鼠疼痛反应;ELISA检测CPu脑区cAMP含量变化;Western blot检测CPu脑区PKA和CREB蛋白表达及磷酸化水平的变化;免疫荧光染色检测CPu脑区A1R表达情况。结果:与盐水组比较,CFA造模显著降低大鼠热痛阈值(P<0.01);与CFA组比较,CFA+MA组和CFA+CCPA组大鼠的热痛阈值均显著升高(P<0.05或P<0.01);与CFA+MA+DMSO组比较,CFA+MA+DPCPX组大鼠的热痛阈值显著降低(P<0.05)。与盐水组和CFA组比较,CFA+MA组大鼠CPu脑区中的A1R蛋白相对表达量和阳性细胞数均显著增加(P<0.05或P<0.01)。与盐水组相比,CFA+MA组大鼠CPu脑区中的cAMP含量显著减少,p-CREB蛋白水平显著降低(P<0.05);与CFA+DMSO组相比,CFA+MA+DMSO组和CFA+CCPA组的cAMP含量显著减少,p-CREB蛋白水平显著下降(P<0.01);与CFA+MA+DMSO组相比,CFA+MA+DPCPX组cAMP含量显著增加(P<0.01),p-PKA和p-CREB蛋白水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:针刺双侧足三里可以缓解CFA大鼠的炎性疼痛,其机制可能与A1R/cAMP/p-CREB信号通路有关。

优化新生脉散方调控β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

目的 基于β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路探讨优化新生脉散方对心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响。方法 50只SD大鼠随机分为假手术组10只和手术组40只,采用左冠状动脉前降支结扎法建立心力衰竭大鼠模型。将成模大鼠随机分为模型组、卡托普利组和中药低、高剂量组,每组8只,给药组分别予相应药物灌胃4周。超声心动图测定大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS),测定心、肺质量并计算心、肺脏器系数,组织病理学观察心肌纤维化程度,ELISA测定血清N端脑利钠肽前体(NT-ProBNP)及心肌组织环磷酸腺苷(cAMP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)含量,免疫组化检测心肌组织β1肾上腺素受体(β1-AR)、cAMP阳性表达,Western blot检测心肌组织β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路相关蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低(P<0.01),心、肺脏器系数明显升高(P<0.01);心肌细胞数目减少、胶原容积分数升高、Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比增加(P<0.01),血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量明显升高,心肌组织cAMP含量明显降低(P<0.01),心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达明显降低(P<0.01),β1-AR、腺苷酸环化酶(AC)1、cAMP、p-蛋白激酶A(PKA)、p-环磷腺苷反应元件结合蛋白(CREB)蛋白表达明显降低,p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,给药组不同程度增加大鼠LVEF、LVFS,降低心、肺脏器系数;增加心肌细胞数目、减少胶原容积分数和Ⅰ/Ⅲ型胶原纤维占比,下调血清NT-ProBNP和心肌组织ColⅠ、ColⅢ含量,上调cAMP含量,增加心肌组织β1-AR和cAMP阳性表达,上调β1-AR、AC1、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表达,抑制p-Smad2、ColⅠ、ColⅢ、α-SMA蛋白表达,其中中药高剂量组和卡托普利组作用更明显(P<0.01,P<0.05)。结论 优化新生脉散方能减轻心力衰竭大鼠心肌纤维化程度,改善心肌肥厚和重构,增加左心室收缩力,其机制可能与激活β1-AR/cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

基于cAMP-PKA-CREB信号通路中药防治血管性痴呆的研究进展

环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)-cAMP响应性元件结合蛋白(CREB)是神经系统一条重要的信号途径,在血管性痴呆(Va D)的防治方面发挥重要作用。中医药是我国治疗Va D的重要手段,其主要优势在于保护脑血管、改善学习记忆与认知功能的效果显著且无明显不良反应。本文基于cAMP-PKA-CREB信号通路在脑血管病变和记忆认知功能方面的调节机制,从单味中药及中药复方的角度综述了中药防治Va D的作用机制,为今后Va D相关基础及临床研究提供理论依据。

基于cAMP信号通路探讨小青龙汤对CFTR离子通道调节哮喘黏液纤毛清除功能的作用机制

目的:观察小青龙汤对哮喘寒饮蕴肺证小鼠环磷酸腺苷(cAMP)、囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)、黏蛋白5AC(MUC5AC)表达的影响,探讨小青龙汤基于cAMP通路对CFTR离子通道改善黏液纤毛清除功能的作用机制。方法:常规卵清白蛋白(OVA)加寒性刺激干预建立小鼠哮喘寒饮蕴肺证模型,于末次激发后取肺组织进行苏木素-伊红(HE)及阿尔辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色,收集支气管肺泡灌洗液及肺组织上清液,检测肺泡灌洗液中MUC5AC水平及肺组织上清液中cAMP、CFTR水平。结果:成功构建哮喘小鼠寒饮蕴肺证模型,小鼠肺泡灌洗液中MUC5AC表达上升,肺组织上清液中cAMP、CFTR表达均下降,肺组织病理切片见气道周围炎症细胞浸润,气道黏液分泌及杯状细胞增生。与模型组比较,地塞米松组、小青龙汤组肺泡灌洗液中MUC5AC表达均下降,小青龙汤组肺泡灌洗液中MUC5AC表达下降幅度小于地塞米松组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,cAMP组、小青龙汤组肺组织上清液中cAMP、CFTR表达均上升,小青龙汤组肺组织上清液中cAMP、CFTR表达上升幅度均小于cAMP组,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理切片见,小青龙汤组支气管周围基本无炎性细胞浸润,支气管管壁及肺泡保持较完整,平滑肌增生、支气管增厚与cAMP组、地塞米松组相比程度较轻,管腔内未见黏液栓及脱落的肺泡上皮。小青龙汤组支气管管壁清晰,杯状细胞增生较少,气道内黏液分泌少于cAMP组、地塞米松组。结论:小青龙汤可以减轻哮喘寒饮蕴肺证小鼠气道黏液高分泌及保障黏液纤毛清除功能运行,作用机制为通过cAMP通路提高CFTR离子通道。

基于cAMP-PKA信号通路调控TRPV1表达研究温和灸治疗原发性痛经大鼠作用机制

目的基于cAMP-PKA信号通路调控瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)表达研究温和灸“神阙”“关元”治疗原发性痛经(PD)大鼠的作用机制。方法将32只雌性未孕Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、温和灸组和辣椒平组,每组8只。除空白组外,其余组采用腹腔注射苯甲酸雌二醇+冰水浴建立PD寒湿凝滞证大鼠模型。造模第1日开始干预,温和灸组选取“神阙”“关元”温和灸,20 min/次,辣椒平组皮下注射辣椒平2 mg/kg,每日1次,连续10 d。观察大鼠扭体行为并进行评分,ELISA检测子宫组织前列腺素F_(2α)(PGF_(2α))、环磷酸腺苷(c AMP)含量,免疫荧光染色检测子宫组织TRPV1表达,Western blot检测子宫组织蛋白激酶A(PKA)、p-PKA、TRPV1蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠扭体潜伏期减少,扭体评分升高(P<0.01);子宫组织PGF_(2α)、cAMP含量升高(P<0.01),TRPV1、p-PKA蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,温和灸组和辣椒平组大鼠扭体潜伏期增加,扭体评分降低(P<0.01);子宫组织PGF_(2α)、cAMP含量降低(P<0.01),TRPV1、p-PKA蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。与温和灸组比较,辣椒平组大鼠扭体潜伏期增加,扭体评分降低(P<0.01);子宫组织PGF_(2α)、cAMP含量降低(P<0.05,P<0.01),TRPV1蛋白表达降低(P<0.05)。结论温和灸“神阙”“关元”对PD大鼠具有明显镇痛作用,其机制可能与调控子宫组织cAMP-PKA信号通路介导TRPV1蛋白表达有关。

重组糖蛋白激素β5/α2调控cAMP/PKA/CREB通路促进3T3-L1细胞脂肪分解的作用及机制研究

目的研究重组糖蛋白激素β5/α2(rCGH)对3T3-L1脂肪细胞脂解的影响,并探究其潜在机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,并诱导分化为成熟脂肪细胞,给予不同浓度rCGH干预24 h。以CCK-8法检测3T3-L1脂肪细胞的细胞活力,酶学方法测定细胞内甘油三酯(TG)及培养上清中甘油的水平,油红O染色观察脂滴变化。Western blot检测各组脂肪细胞中HSL和ATGL脂解蛋白的表达水平。不同浓度rCGH加或不加PKA抑制剂H89对已分化成熟的3T3-L1脂肪细胞进行联合干预实验,将培养细胞分为对照组、H89预处理组、1μmol·L^(-1)rCGH组和(1μmol·L^(-1)rCGH+H89)联合干预组。酶法测定胞内TG及游离甘油的含量,Western blot检测CREB及脂解相关蛋白的表达。结果不同浓度rCGH(0.25、0.5、1、2μmol·L^(-1))对脂肪细胞细胞活力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,rCGH处理显著降低了脂滴大小和细胞内TG含量,同时显著升高了细胞上清液中的甘油浓度。rCGH处理还刺激了p-HSL、ATGL和p-PKA的蛋白表达。此外,加入PKA抑制剂H89,减弱了rCGH对游离甘油水平、细胞内TG含量以及p-HSL、p-PLIN1和p-CREB表达的影响。结论rCGH通过上调HSL、ATGL和PKA活性促进3T3-L1脂肪细胞的脂质分解,促进甘油释放,抑制TG合成和脂质积累,其作用机制与cAMP/PKA/CREB信号通路激活有关。