鸡群中鸡传染性贫血病原与抗体检测及分离株VP1基因序列分析

为了解鸡群中鸡传染性贫血病毒(CAV)感染及抗体产生情况,从黑龙江省两个无临床症状鸡群(B群和S群)中,分别采集血清通过ELISA方法进行抗体检测,采集抗凝血并分离淋巴细胞,针对基因组保守序列设计引物,通过PCR方法进行病原检测,并对从B群病原阳性鸡分离到的分离株进行VP1基因序列分析。结果显示,B群和S群CAV抗体阳性率分别为62.7%(79/126)和68.2%(88/129),病原阳性率分别为43.0%(49/114)和62.3%(48/77),其中,B群和S群中抗体和病原双阴性的鸡分别为23.7%(27/114)和15.6%(12/77),而抗体和病原双阳性的鸡分别高达28.1%(32/114)和46.8%(36/77);在双阳性鸡中,B群和S群分别有62.5%(20/32)和58.3%(21/36)抗体滴度在1.0×10^(4)及以上,从B群病原阳性鸡全血中分离到一株CAV(HLJ/2022株),分离株HLJ/2022第394位氨基酸为谷氨酰胺,具有强毒的分子特征;两个鸡群的环境拭子CAV阳性率为10.0%(3/30),存在于消毒前的鸡蛋表面、更衣处和鞋底。研究表明,检测鸡群的CAV抗体阳性率在62.7%以上,病原阳性率在43.0%以上,抗体滴度在1.0×104及以上CAV仍可存在,CAV流行株(HLJ/2022)具有强毒分子特征,鸡群环境中存在CAV污染,结果为CIA防控提供重要的参考意见。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

鸭3型甲肝病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

【目的】探明引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原及其遗传进化特征。【方法】对安徽省某鸭场的病死雏鸭中采集的出血肝脏开展鸭已知病原核酸检测、病原分离鉴定和动物回归试验,在明确其病原为鸭3型甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 3,DHAV-3)的基础上分析其VP1基因序列分子特征。【结果】细菌分离结果显示,未分离到细菌;经病毒核酸(RT-)PCR检测结果显示,鸭3型甲肝病毒(DHAV-3)核酸阳性,未检测出其他已知引起鸭肝出血的病毒核酸。将该阳性样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种后鸭胚发生死亡,胚体全身出血,对第5代尿囊液经RT-PCR检测为DHAV-3,将其命名为AH230225。经测定,该分离株的鸭胚半数致死量(Effective lethal dose 50,ELD_(50))为10^(−4.17)/0.1 mL。动物回归试验表明,该毒株对樱桃谷雏鸭的致死率为80%,且攻毒死亡鸭肝脏和肾脏的剖检病变与临床典型病变相近。对该分离毒的VP1基因核苷酸序列进行同源性分析,显示AH230225株的VP1基因核苷酸序列与AH07株DHAV-3(安徽分离株)的同源性最高,为98.8%,与GenBank登录的10株DHAV-3分离株VP1基因核苷酸序列同源性为90.4%~98.8%,而与DHAV-1和DHAV-2的VP1基因核苷酸序列同源性分别为62.1%~63.0%、64.6%~64.9%;基于VP1蛋白氨基酸序列的遗传进化显示,该分离株与AH07株DHAV-3处于同一小进化分支上,亲缘关系最近;而与SD01株、G株和韩国株(AP-04009、AP-03337)等亲缘关系较远,即远离DHAV-1和DHAV-2进化分支。【结论】引起安徽某鸭场雏鸭肝脏出血和大量死亡的病原为鸭3型甲肝病毒DHAV-3,同时明确了该毒株VP1基因的分子特征及遗传进化规律,为深入研究DHAV-3的致病机制和制定防控措施提供科学依据。

猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

北京地区猫杯状病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解猫杯状病毒(FCV)新流行毒株的流行情况、变异特点及致病性,通过收集2016-2022年4月北京地区多家宠物医院就诊疑似感染FCV的猫眼、鼻、咽拭子进行RT-PCR检测和分离培养,对分离到的5株FCV进行病毒含量测定、VP1基因序列分析,并对其中1株进行致病性试验。结果显示,2018-2022年4月阳性率分别为36.98%、34.30%、41.33%、40.46%和34.39%,总阳性率为37.93%。5株FCV分离株VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为74.1%~85.4%和83.6%~91.0%;5株FCV分离株与国内疫苗株255株核苷酸和氨基酸同源性分别为74.8%~84.5%和83.7%~91.6%;与国内疫苗株255株、国外疫苗株F9株在不同的小分支上。致病性试验结果显示,猫感染BJH13株FCV后出现精神沉郁、食欲减退、体温升高、体重下降、眼鼻分泌物增多和舌泛红、溃疡等典型感染FCV临床症状;FCV感染猫的舌和肺脏组织病理切片结果显示,FCV侵染猫舌和肺脏并呈典型感染FCV病理特征。以上结果表明,FCV阳性率高;分离株BJH13株致病力强;FCV VP1基因序列变异大,与目前临床使用的疫苗株255、F9株VP1基因存在明显差异,存在疫苗免疫失败的风险。这对现阶段FCV防控带来了巨大挑战,同时为今后的疫苗研发提供了候选毒株和科学依据。

新疆和田地区鹅细小病毒感染调查及VP1基因遗传进化分析

为了解新疆和田地区鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)的感染情况及遗传进化特征,试验采集新疆和田地区和田县、于田县、皮山县鹅养殖场的578只死亡雏鹅的内脏(肝脏、脾脏)及肛拭子样本(和田县344只,于田县67只,皮山县167只),采用PCR方法对鹅细小病毒进行检测,并随机选取2份阳性病料样本对鹅细小病毒VP1基因进行PCR扩增、测序、BLAST比对和遗传进化分析。结果表明:共检测出44份鹅细小病毒阳性样品,总阳性率为7.61%(44/578),其中新疆和田地区和田县鹅细小病毒阳性率为12.50%(43/344),于田县鹅细小病毒阳性率为1.49%(1/67),皮山县未检测到鹅细小病毒。随机选取的2株鹅细小病毒(XJHT-1、XJHT-2株)均为经典鹅细小病毒,与鹅细小病毒各参考毒株VP1基因编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~95.8%和92.1%~97.3%,与番鸭细小病毒参考毒株VP1基因编码氨基酸序列相似性分别为76.0%~85.4%和78.5%~88.7%。鹅细小病毒XJHT-1、XJHT-2株与鹅细小病毒DY16株(中国江苏)的相似性最高,分别为95.8%和97.3%,遗传距离最近;XJHT-1株与鹅细小病毒GD株(中国广东)和SD-F30株(中国河北)的相似性较低,分别为89.5%和89.6%;XJHT-2株与鹅细小病毒SHM319株(德国)、GD株(中国广东)和SD-30株(中国河北)的相似性较低,分别为92.1%、92.8%和92.8%。说明和田地区部分鹅场存在鹅细小病毒的感染,但阳性率较低,选取的2株毒株与鹅细小病毒DY16株(中国江苏)的氨基酸序列相似性最高,推测可能由鹅细小病毒DY16株进化而来。

云南省昆明地区2022年柯萨奇病毒A16型的VP1区分子特征

目的对昆明市某医院2022年从手足口病患儿分离的柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的全VP1基因区分子特征分析。方法对昆明市某医院2022年从手足口病(hand foot mouth disease,HFMD)患儿200份临床样品粪便标本进行处理,分别通过RD细胞和Vero细胞分离,对经3次培养后仍产生细胞效应(cytopathogenic effect,CPE)的细胞培养液提取病毒核酸,然后用通用引物222/224经RT-PCR扩增并测序,序列经BLAST比对确定其血清型,对鉴定为柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)的再用特异引物CA16VP1F/CA16VP1R扩增其全VP1区并测序和拼接。下载CVA16病毒标准序列,采用Geneious 5.4.1和MEGA 6.05等软件对本研究CVA16的全VP1区的核苷酸和氨基酸序列分析。结果经鉴定后共检出22株从Vero细胞分离CVA16和6株RD细胞分离的CVA16毒株,进一步通过特异引物扩增获得21株可用的CVA16VP1全长序列,基于全VP1基因系统进化分析,这21株CVA16全属于B1a基因型。21株CVA16全长VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为91.9%~99.6%和89.2%~99.3%;与中国CVA16 B1a基因型的其他株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.7%~96.3%和89.2%~97.0%。与CVA16 B1b其他参考株对比,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在84.3%~87.2%和89.2%~97.0%。与其它CVA16的B1a基因亚型相比较发现21个氨基酸位点出现变异。结论2022年中国云南省昆明某医院引起HFMD的CVA16毒株属于B1a基因型,应继续监测以明确其流行特征。

2020—2023年山东地区13株3型鸭甲型肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为研究2020—2023年山东地区3型鸭甲型肝炎病毒的流行变异情况,试验采集了山东地区13份疑似鸭肝炎病毒感染的病料,通过病毒分离、RT-PCR扩增鉴定,并进行VP1基因测序及遗传变异分析。结果显示:共分离到13株3型鸭甲型肝炎病毒,均属于GⅠa分支,且分属于GⅠa分支不同小分支,其中2020年分离株(20148、20149)与2021年商品肉鸭分离株(SP21042)核苷酸相似性在98.8%~100%;2023年商品鸭分离株(SP23012、SP23014、SP-2、SP-3、SP23009)核苷酸相似性在99.7%~100%;2021年种鸭分离株(21083)与2022年、2023年种鸭分离株(22443、22468、BL23028)、2023年商品鸭分离株(SP23010)核苷酸相似性在98.8%~99.4%,小分支内相似性均高于98.8%,不同小分支间相似性在96.9%~98.2%;2023年部分3型DHAV分离株VP1基因出现了个别氨基酸位点的突变。研究表明,山东地区分离的13株GⅠa分支鸭甲型肝炎病毒VP1基因出现了变异,需要加以关注。

猪萨佩罗病毒HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征

猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明:实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20~30 aa、90~100 aa和265~275 aa。本研究为PSV感染的诊断与预防提供依据,并为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

表达GⅡ.4型诺如病毒VP1复制缺陷型腺病毒构建与鉴定

人诺如病毒(norovirus,NoV)在体外难以培养,不宜采用经典疫苗的方式进行疫苗研发,以腺病毒为载体的重组腺病毒疫苗为诺如病毒疫苗的研发提供另一种路线选择。构建表达人GⅡ.4型诺如病毒VP1蛋白的重组腺病毒为该技术路线的疫苗研发奠定基础。首先使用PCR扩增诺如病毒VP1片段,通过酶切、连接、转化,克隆含VP1基因的pshuttle-CMV-VP1穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒进行同源重组,重组质粒鉴定正确后使用PacⅠ酶切线性化,转染至HEK293细胞进行病毒包装,包装成复制缺陷型的完整腺病毒颗粒命名为rAd-VP1,病毒传代后进行滴度测定,并感染HEK293细胞,通过Western Blot方法鉴定重组腺病毒外源蛋白VP1的表达情况。结果表明,包装传代后的重组腺病毒浓缩后滴度达到CCID_(50)=5×10^(9)/mL,并且能在HEK293细胞成功表达VP1蛋白。研究为rAd-VP1的动物免疫评价和诺如病毒的疫苗研发提供基础。

2021年中国部分地区鸡传染性贫血病毒VP1基因遗传变异分析

为全面了解鸡传染性贫血病毒(CIAV)在我国的流行情况和VP1基因遗传变异情况,研究对2021年全国25个省市421份疑似CIAV或其他病原感染的临床样本进行鉴定。结果显示,共有64份临床样本的VP1基因PCR鉴定为阳性,序列对分析发现有59株VP1基因位于基因A型分支,5株VP1基因位于基因C型分支,氨基酸位点分析发现第394位氨基酸为谷氨酰胺(Q),与3-1株、CAV-10株等高致病性CIAV一致,且第75、89、125、139、141、144位氨基酸位点也出现了不同程度的变异。研究表明目前我国鸡群流行的CIAV以A型为主,且VP1基因存在变异,结果为了解CIAV在我国的变异情况及传染性贫血防控提供了数据参考。

猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】原核表达猪塞内卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)VP1蛋白,制备SVV-CH-HB2016 VP1蛋白多克隆抗体并分析其抗原性,为进一步研发SVV病毒诊断试剂盒和亚单位疫苗提供参考依据。【方法】对SVV-CHHB2016 VP1基因序列进行密码子优化,构建质粒pUCK/VP1-opt,双酶切后连接至pET-28a(+)载体,构建原核表达质粒pET-28a-VP1。将重组质粒pET-28a-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)分子伴侣感受态细胞,经IPTG诱导表达获得重组VP1蛋白。采用Western blotting方法分析VP1蛋白的反应原性,并以包涵体变性和复性方式纯化。随后将VP1蛋白免疫新西兰白兔,分离血清获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定抗体的效价水平,以Protein A+G Agarose抗体纯化试剂盒纯化多克隆抗体。通过Western blotting和间接免疫荧光抗体试验(IFA)法验证多克隆抗体与SVV-CH-HB2016毒株反应的特异性。【结果】成功构建原核表达质粒pET-28a-VP1,在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、37℃诱导4 h条件下,重组VP1蛋白成功表达并主要以包涵体形式存在;Western blotting分析结果显示,重组VP1蛋白可与His-Tag Mouse mAb发生特异性结合,具有良好的反应原性;经变性和复性纯化的重组包涵体蛋白纯度和浓度均较高;采用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶32000;纯化后的抗体无明显杂带,纯度大于90.0%;Western blotting和IFA鉴定结果表明,多克隆抗体可特异性识别SVV-CH-HB2016毒株,重组VP1蛋白具有较好的免疫原性。【结论】通过原核表达SVV VP1蛋白获得的重组VP1蛋白具有较好的抗原性,制备的多克隆抗体特异性良好,可作为诊断试剂盒及亚单位疫苗研制的候选抗原。

A型塞内卡谷病毒SDMY-CH-2021的分离鉴定及全基因组序列分析

为了查明山东省某养猪场水疱性传染病的病原体,试验采集了该养猪场猪只的水疱皮病料,并采用RT-PCR、病毒分离纯化、基因测序及分子生物学分析等方法对样品进行了病毒分离、鉴定和全基因组序列测定。结果表明:确诊该养猪场猪只发生水疱性传染病的病因为A型塞内卡谷病毒(SVA)感染,同时排除了猪口蹄疫病毒和猪水疱病病毒混合感染的情况,并成功分离到一株SVA,命名为SDMY-CH-2021株。该分离株在BHK-21细胞中盲传3次可引起明显的致细胞病变效应,噬斑纯化3代测定其TCID_(50)为1×10^(-8.2)/100μL;基因全长为7388 bp,开放阅读框大小为6546 bp,编码2181个氨基酸。与参考毒株相比,该分离株与广州分离株CH-01-2015和武汉分离株HB-CH-2016亲缘关系较近;VP1蛋白氨基酸序列与美国首个分离株SVV-001的VP1蛋白氨基酸序列相似性最低,为92.5%;VP1蛋白存在9个B细胞线性抗原表位,相较于参考毒株VP1蛋白的氨基酸序列存在多处突变及缺失。说明分离株SDMY-CH-2021发生了部分基因变异。

网络反预期对举格式“一个敢VP_(1),一个敢VP_(2)”探析

“一个敢VP_(1),一个敢VP_(2)”是近几年流行于网络上的对举格式,大多见于新闻或时评标题。从形式上看,该格式由表个指或类指的数量短语“一个”、情态动词“敢”、简化概括的VP_(1)、VP_(2)组构而成。主观性、语境依赖性以及VP_(1)与VP_(2)语义地位不等是该格式在表意上体现出来的特征。该格式具有反预期性,与特定言语社会共享的预期相反,且其内部具有反预期等级性;场景简描、间接评价、焦点凸显以及浓缩诱导是该格式的表达功能。

2021—2023年安徽省手足口病柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)发病情况、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况和VP1基因进化特征。方法通过中国疾病预防控制信息系统对2021—2023年安徽省HFMD发病情况和病原学检测情况进行统计。收集HFMD患者咽拭子样本,分离得到CVA16毒株,对其VP1区进行PCR扩增和基因序列测定,使用肠道病毒在线分型工具鉴定基因亚型,运用MegAlign比较核苷酸和氨基酸同源性,利用MEGA 6.0构建进化树,并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2021—2023年安徽省累计报告HFMD病例155640例,年均报告发病率为84.83/10万。2021—2023年安徽省16个地市共报告HFMD实验室确诊病例12643例,其中CV-A16占18.16%(2296/12643),各年度构成比分别为25.81%(1127/4366)、33.69%(782/2321)和6.50%(387/5956)。2021—2023年安徽省共分离到HFMD CV-A16毒株72株,其中B1a和B1b基因亚型分别为58株(占80.56%)、14株(占19.44%)。两种亚型毒株与CV-A16原型株G-10的核苷酸和氨基酸同源性分别为73.80%~76.20%和90.60%~92.30%。进化树显示B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株形成3个分支簇。72条VP1区基因序列与原型株比较发现了26个氨基酸位点发生变异。结论2021—2023年安徽省HFMD CV-A16主要流行的基因亚型为B1a和B1b,B1a为优势基因亚型,应加强对CV-A16流行毒株的分子监测。

外周血中抗EV71 VP1特异性抗体分泌细胞检测方法的建立

目的应用酶联免疫斑点(ELISPOT)技术,建立一种检测外周血中抗EV71VP1特异性抗体分泌细胞的方法,并评价该方法在检测EV71感染诊断中的应用价值。方法无菌分离外周血中单个核细胞,建立一系列特异性ELISPOT检测外周血VP1抗原特异性抗体分泌细胞的参数:包括抗原最佳包被浓度、反应体系中细胞浓度以及HRP标记抗体工作浓度的确定,与ELISA比较,检测方法的敏感性和特异性。结果当抗原包被浓度为20μg/mL时,不同细胞浓度反应曲线最稳定;细胞浓度为5×10^(6)/mL时,不同包被浓度形成的斑点数适量,易于计数;HRP标记抗体释稀度为1:10000时,背景最浅容易识别。ELISPOT敏感性为90.0%,特异性96.7%。与ELISA检测抗EV71抗体方法比较,ELISPOT优于ELISA。结论该方法有较高的特异性和灵敏度,有望成为诊断EV71感染的一种理想方法。

口蹄疫病毒VP1蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 。