HLA-A*0201转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型的建立与鉴定

【目的】建立HLA-A*0201转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型,并进行实验室鉴定。【方法】在真菌孢子感染前,给予HLA-A*0201转基因小鼠腹腔注射环磷酰胺。乙醚麻醉后,小鼠经鼻腔吸入3组不同浓度的(3×106、3×107、3×108mL-1)烟曲霉孢子悬液。阴性对照组小鼠吸入PBS。感染后36 h,处死各组小鼠,取肺组织病理行HE、PAS以及GMS染色分析,以验证感染是否成功并计算肺侵袭性肺烟曲霉感染小鼠模型成模率。肺组织研磨涂皿后行菌落计数,分析小鼠肺烟曲霉负载量。【结果】小鼠肺组织病理检查显示,正常肺组织结构遭到显著破坏,大量菌丝生长并可见菌丝侵犯血管现象,证实侵袭性肺曲霉病模型造模成功。在免疫抑制的方法和条件恒定时,3种孢子浓度由低到高成模率分别为36.7%、76.7%、96.7%。各实验组成模小鼠肺组织研磨液在PDA培养基上均有大量烟曲霉菌落生长,未感染小鼠组未见烟曲霉菌落生长。【结论】成功建立HLA-A*0201转基因小鼠侵袭性肺曲霉病模型,在免疫抑制的方法和条件恒定时,模型成模率与接种孢子悬液的浓度成正比,采用高浓度的孢子悬液(3×108mL-1)时,可以达到较高的成模率。

人黑色素瘤抗原MAGE-3肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性的观察

目的通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗,并观察其对HLA-A*0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法用RT-PCR的方法,从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段,分别将其插入到pcDNA3.1/V5-His真核和pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达;将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后,采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HLA-A*0201转基因小鼠,LDH方法检测CTL活性。结果酶切结果证实,成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体,并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达,原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫,镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后,可成功地诱导HLA-A*0201转基因小鼠CTL活性。结论成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原,为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。