CD8＋CD28-调节性T细胞的生物学特性及其与疾病的相关性研究进展

CD8+CD28-调节性T细胞(T regulatory cells,Treg)是具有免疫调节功能的异质性细胞群,在维持机体免疫功能稳态及建立免疫耐受中发挥着重要作用,其功能缺失或数量改变与衰老、肿瘤、感染、移植排斥、自身免疫疾病等的发生发展密切相关。CD8+CD28-Treg经体外诱导而来,通过细胞间直接接触或分泌抑制性细胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10)发挥免疫调节功能,但目前尚未明确其独特表型。对CD8+CD28-Treg进行深入研究将有助于了解机体免疫调节机制,进而对免疫相关疾病进行有效的干预。

食管癌患者外周血MAGE-C2抗原特异性CD8^+ T细胞的功能及临床意义

目的:评价食管癌患者外周血恶性黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)-C2抗原特异性CD8^+ T细胞的功能,并分析其与临床病理参数的相关性。方法:密度梯度离心法获取130例食管癌初治患者(收集自2014年11月至2015年11月郑州大学第一附属医院胸外科)的PBMC,流式细胞术、RT-PCR方法筛选HLA-A2*0201和MAGE-C2共阳性的患者,其PBMC培养7、14 d后加MAGE-C2(336-344)抗原肽1μg/ml、IL-2 100μg/ml和CD3/CD28 Dynabeads 2μl处理,诱导扩增抗原特异性CD8^+ T细胞,流式细胞术检测CD8^+ T细胞表面CD107a和胞内IFN-γ的水平,并分析其与临床参数的相关性。结果:筛选出52例HLA-A2*0201和MAGE-C2共阳性的患者,MAGE-C2(336-344)处理其PBMC后,MAGE-C2(336-344)处理组CD8^+ T细胞中CD107a^+IFN-γ^+,CD107a^+IFN-γ^-和CD107a^-IFN-γ^+细胞的比例明显升高(P<0.05);CD107a的表达在早期、未发生淋巴结转移和高分化的食管癌患者明显高于晚期、发生淋巴结转移和低分化的癌症患者(P<0.05);IFN-γ的表达在高分化的食管癌患者明显高于低分化的食管癌患者(P<0.05)。结论:成功诱导扩增MAGE-C2抗原特异性CD8^+ T细胞,并发现其功能与食管癌的分期和淋巴结转移相关,似可作为一种理想的免疫治疗靶点。

Galectin-9阳性肿瘤相关巨噬细胞在肌层浸润性膀胱癌中的表型、功能及临床治疗意义

目的·分析半乳糖凝集素9阳性肿瘤相关巨噬细胞(galectin-9^(+)tumor-associated macrophages,galectin-9^(+)TAMs)在肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)组织中的表型特征,探究MIBC微环境对galectin-9^(+)TAMs的调控作用,galectin-9^(+)TAMs抑制CD8^(+)T细胞反应的机制及其临床治疗意义。方法·通过流式细胞术检测MIBC与癌旁组织中galectin-9^(+)TAMs的表型特征。利用TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库筛选与LGALS9和LGALS9巨噬细胞基因集显著相关的细胞因子。用人重组细胞因子体外刺激巨噬细胞,分为人重组巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human macrophage-stimulating factor,rh M-CSF)刺激组、人重组白介素-16 (recombinant human interleukin-16,rh IL-16)刺激组和人重组干扰素γ (recombinant human interferon-γ,rh IFN-γ)刺激组,并通过流式细胞术检测3组galectin-9表达情况。流式细胞术检测加入rh M-CSF中和性抗体后巨噬细胞表达galectin-9的情况。Anti-galectin-9抗体处理MIBC单细胞悬液后,通过流式细胞术检测TAMs的效应功能变化。分选癌与癌旁组织中galectin-9^(+)TAMs和人外周血CD8^(+)T细胞并进行体外共培养,通过流式细胞术检测CD8^(+)T细胞效应功能变化。采用anti-galectin-9抗体和程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1,PD-1)抗体单独及协同处理体外培养的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡及CD8^(+)T细胞效应功能变化。结果·Galectin-9^(+)TAMs高表达人类白细胞DR抗原(human leukocyte antigen DR,HLA-DR)、CD86、CD206和细胞程序性死亡-配体1 (programmed cell death-ligand 1,PD-L1),分泌IL-10和转化生长因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)增加,分泌肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)减少。TCGA数据库筛选结果显示,M-CSF、IL-16和IFN-γ与LGALS9和LGALS9巨噬细胞基因集的相关性最显著。用rh M-CSF、rh IL-16和rh IFN-γ体外刺激巨噬细胞,rh M-CSF刺激组中galectin-9的表达显著升高,加入中和性抗体后表达显著下调。阻断galectin-9后,TAMs表型从高表达抑制性分子向促炎症分子转换,其表面表达PD-L1显著下降。体外共培养galectin-9^(+)TAMs和CD8^(+)T细胞后,galectin-9^(+)TAMs能够抑制CD8^(+)T细胞的效应功能,该作用部分依赖于galectin-9。联合阻断galectin-9和PD-1后,肿瘤细胞凋亡比例、CD8^(+)T细胞的增殖能力和效应分子的分泌与单独阻断PD-1相比,均显著增多或增强。结论·Galectin-9^(+)TAMs具有免疫抑制表型和功能。肿瘤来源M-CSF诱导TAMs高表达galectin-9。Galectin-9^(+)TAMs抑制CD8^(+)T细胞功能从而促进MIBC免疫逃逸。联合阻断galectin-9和PD-1能够更有效地重激活CD8^(+)T细胞功能。

恩度联合力扑素同步放疗对中晚期宫颈癌患者血清CYFRA21-1、CEA、SCCA、CA125、IL-8及免疫细胞水平的影响

目的:探讨恩度联合力扑素同步放疗对中晚期宫颈癌患者血清细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokerantin-19-fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、鳞状细胞癌相关抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)、糖类抗原125(cancer antigen 125,CA125)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)及免疫细胞水平的影响。方法:选择2014年1月~2016年2月在我院确诊的72例中晚期宫颈癌患者,随机分为实验组(n=36)和对照组(n=36),对照组单纯给予放射治疗,实验组给予恩度联合力扑素同步放疗,3周为1个疗程,两组均接受治疗4个疗程,检测并比较两组治疗前后血清CYFRA21-1、CEA、SCCA、CA125及IL-8水平及外周血CD3^+、CD4^+、CD8^+免疫细胞所占的比值。结果:治疗前,两组血清CYFRA21-1、CEA、SCCA、CA125及IL-8水平比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组血清CYFRA21-1、CEA、SCCA、CA125及IL-8水平均明显低于治疗前,同时实验组以上各血清指标均明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。治疗前,两组外周血CD3^+、CD4^+及CD8^+细胞所占比值比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组外周血CD3^+、CD4^+细胞所占比值明显低于治疗前,CD8^+细胞所占比值明显高于治疗前,同时实验组各T淋巴细胞亚群所占比值改变优于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:恩度联合力扑素同步放疗能明显降低中晚期宫颈癌患者血清CYFRA21-1、CEA、SCCA、CA125及IL-8水平,改善T淋巴细胞亚群水平,提高患者免疫力,值得在临床上推广应用。

超抗原SEB对CD8^+T细胞凋亡诱导配体表达的影响

为了探讨超抗原SEB对CD8+ T细胞凋亡诱导配体在细胞胞内和膜表面表达的影响 ,以SEB及PHA刺激PBMC ,用免疫荧光染色结合三色流式细胞术 ,分析比较刺激前后PBMC中CD8+ T细胞三种主要的凋亡诱导配体TRAIL、FasL和TNF -α在细胞胞内和膜表面表达的变化。结果表明 ,SEB上调FasL在CD8+ T细胞胞内 (34.8%至 4 2 .5 % )和TRAIL在CD8+ T细胞膜表面 (7%至 2 0 .7% )的表达 ,SEB还可同时上调TNF -α在CD8+ T细胞膜表面 (7%至 4 5 .7% )及胞内 (2 3.9%至 88.7% )的表达。说明SEB能上调不同凋亡诱导配体在CD8+ T细胞膜表面或胞内的表达 ,这可能是SEB影响CD8+ T细胞效应功能的方式之一。

皮肌炎患者外周血T淋巴细胞减少与RIG-I路径的联系

目的 研究皮肌炎患者外周血T淋巴细胞减少与视黄酸诱导基因-I(RIG-I)路径联系。方法 选取2020年8月—2023年8月收治的60例皮肌炎(皮肌炎组)及60例正常健康者(对照组)。检测分析2组外周血液中T淋巴细胞及RIG-I路径核因子-κB(NF-κB)、干扰素调节因子-3(IRF-3)、干扰素调节因子-7(IRF-7)蛋白表达水平及相关性。外周血T淋巴细胞与RIG-I路径相关蛋白相关性应用Pearson分析。结果 皮肌炎组CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+低于对照组,NF-κB蛋白、IRF-3蛋白、IRF-7蛋白、RIG-I蛋白高于对照组(P<0.01);活动期患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+低于非活动期患者,NF-κB蛋白、IRF-3蛋白、IRF-7蛋白、RIG-I蛋白高于非活动期患者(P<0.01);皮肌炎组、活动期患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+与NF-κB蛋白、IRF-3蛋白、IRF-7蛋白、RIG-I蛋白呈负相关(P<0.01);对照组、非活动期患者CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+与NF-κB蛋白、IRF-3蛋白、IRF-7蛋白、RIG-I蛋白无相关性(P>0.05)。结论 皮肌炎患者外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+降低,RIG-I路径活性增强,二者均与病情活动情况有关,且外周血T淋巴细胞与RIG-I路径具有负调控作用,在皮肌炎发生与病情活动中可能起到相互作用。

胰腺癌患者外周血sPD-L1的表达水平及其与免疫功能的相关性分析

目的探究胰腺癌患者外周血可溶性程序性死亡分子-配体1(sPD-L1)的表达水平及其与免疫功能的相关性。方法回顾性分析2014年1月—2016年12月64例胰腺癌患者的临床资料,以入院时血浆sPD-L1水平中位数为界将其分为高表达组(≥3.61 ng/ml)与低表达组(<3.61 ng/ml),每组32例。比较2组的临床特征、CD8+和CD4+T淋巴细胞、干扰素-γ(IFN-γ)、总生存期(OS)的差异,采用Pearson相关系数模型分析血浆sPD-L1水平与免疫功能指标以及OS的相关性。结果2组年龄、性别、病理类型、肿瘤直径以及外周血IFN-γ水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。高表达组临床分期明显晚于低表达组,外周血CD8+、CD4+T淋巴细胞水平明显低于低表达组,中位OS明显短于低表达组(P<0.05,P<0.01)。外周血sPD-L1与CD8+、CD4+T淋巴细胞水平以及OS呈负相关性(P<0.05,P<0.01),而与IFN-γ水平则未见显著相关性(P>0.05)。结论胰腺癌患者外周血sPD-L1表达水平与免疫系统功能甚为密切,在评估预后、确立免疫治疗策略方面有较高临床价值。

乌司他丁对多发伤并发脓毒症病人炎症状态及T细胞亚群的影响

目的探讨乌司他丁在多发伤并发脓毒症病人临床治疗中的应用效果。方法回顾性分析2017年4月至2019年4月苏州第九人民医院收治的106例多发伤并发脓毒症病人病例资料,根据治疗方式的不同将所有病人分为两组,各53例。对照组仅予以抗感染等常规治疗,观察组在对照组基础上加用乌司他丁静脉滴注治疗,2次/天。两组均连续给药1周。比较两组病人炎症状态、T细胞亚群变化情况、血流动力学参数及临床治疗总有效率。结果治疗后两组病人各血清炎性因子水平超敏C反应蛋白(hs-CRP)、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、降钙素原及白细胞介素-6(IL-6)均有所降低,且观察组低于对照组[(20.85±3.06)mg/L比(38.16±4.27)mg/L,(21.94±3.18)mg/L比(33.05±4.16)mg/L,(0.71±0.32)g/L比(1.29±0.44)g/L,(215.63±28.49)ng/L比(279.14±36.85)ng/L,P<0.05];与治疗前相比,两组CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)均有所提高,CD8^(+)均降低,且观察组CD3^(+)(60.12±9.84)%比(47.08±7.35)%、CD4^(+)(44.96±8.15)%比(44.96±8.15)%、CD4^(+)/CD8^(+)(1.59±0.83)比(1.17±0.69)指标高于照组,CD8^(+)(27.04±5.39)%比(33.07±6.22)%指标低于对照组(P<0.05);治疗后两组病人心脏指数、每搏量指数(SVI)、全心舒张期末容积指数(GEDVI)、平均动脉压(MAP)及中心静脉压(CVP)均高于治疗前,心率低于治疗前,且观察组心脏指数、SVI、GEDVI、MAP及CVP指标高于对照组,心率指标低于对照组(P<0.05)。观察组总有效率94.34%(50/53)与对照组总有效率90.57%(48/53)相比,差异无统计学意义(χ^(2)=0.541,P=0.462)。结论将乌司他丁用于多发伤并发脓毒症病人治疗中可有效帮助其降低机体炎性反应,同时改善免疫功能及血流动力学参数,临床疗效确切。

原发性胆汁性胆管炎患者CD8＋T细胞及FoxP3＋CD4＋T细胞中程序性死亡受体-1表达分析

目的研究原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者CD8＋T细胞和FoxP3＋CD4＋T细胞表面程序性死亡受体（PD）-1表达情况。方法收集69例就诊于北京协和医院的PBC患者的外周血及临床资料，根据是否接受过治疗分为初治组和复诊组，在复诊组中根据治疗反应分为难治组和稳定组；同时收集58名健康对照外周血。采用流式细胞术检测PD-1在PBC患者CD8＋T细胞和FoxP3＋CD4＋T细胞的表达情况，应用独立样本t检验和Pearson相关性分析，探究各组间表达差异及其与临床指标相关性。结果69例PBC患者外周血CD8＋T细胞PD．1表达[（12±9）％]比健康对照[（20±12）％]降低（t=-3．687，P〈0．01），PBC患者调节性T细胞比例[（5．6±3．7）％]较健康对照[（7．4±2．4）％]下降（t=2．048，P〈0．01），且PD．1＋细胞占F0xP3＋CD4＋T细胞比例升高[（30±12）％]与[（26±8）％]（t=-2．858，P〈0．05）。未发现CD8＋T细胞及其PD-1表达、调节性T细胞比例与各项临床指标存在相关性（P〉0．05）。调节性T细胞的PD．1表达率与PBC全球评分之间呈负相关（r=-0．307，P〈0．05）。结论PBC患者外周血PD．1在CD8＋T细胞表达较健康人减少，且在难治组患者中下降更为显著；FoxP3＋CD4＋T细胞表面PD-1表达较健康人水平升高，与预后PBC全球评分存在负相关，提示PD-1／PD-L1通路参与PBC发病的免疫机制。

淋巴瘤相关抗原肽刺激所获细胞毒性T细胞克隆的特征

目的研究抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆识别靶细胞的肽特异性和人类白细胞抗原(HLA)限制性,以及其赖以识别抗原肽的T细胞受体(TCR)基因表达序列的分子特征。方法利用体外CTL刺激扩增体系,应用免疫球蛋白重链可变区(IgHV)框架区上的B淋巴瘤相关抗原九肽(IgHV1QLVQSGAEV和IgHV3SLYLQMNSL)负荷的抗原递呈细胞(APC),刺激正常HLAA0201供者的外周血单个核细胞(PBMC),每周1次共4次,用流式细胞仪检测体外培养细胞的免疫表型的变化,并用肽/主要组织相容性基因复合体(MHC)四聚体方法检测肽特异性的CTL增殖情况。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CTL与不同的靶细胞共同孵育时释放干扰素γ(IFNγ)的能力。应用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)和T细胞受体(TCR)基因指纹谱型图方法检测培养前后的淋巴细胞的克隆变化,并用直接测序的方法得到CTL克隆的TCR基因序列。结果B淋巴瘤相关抗原肽4次刺激体外培养的PBMC后CD8+CTL大量增殖,CD4/CD8明显下降(0.10vs1.43,P<0.05)。IgHV1QLVQSGAEV/HLAA0201四聚体和CD8双阳性的肽特异性CTL数量(49.38%)比刺激前(0.04%)明显上升。ELISA检测IFNγ的分泌表明其识别靶细胞是肽特异性和HLA限制性的。TCR基因指纹谱型图显示抗原肽反复刺激获得的CTL的TCR表达集中于个别基因家族,呈克隆性增殖。结论应用IgHV基因框架区来源的B淋巴瘤相关抗原九肽可以使特异性CTL克隆增殖,这些克隆以肽特异性和HLA限制性的方式识别靶细胞。了解这些CTL的作用和TCR识别相关抗原肽的分子结构,将有助于确定体内T细胞和B细胞相互调节的机制。

索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎患者疗效临床研究

目的探讨应用索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎(CHC)患者的疗效及血清细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)和白介素-12(IL-12)水平的变化。方法2018年5月~2019年5月我院肝病科就诊的105例CHC患者,采用随机数字表法将所选患者分为对照组51例和观察组54例,分别给予利巴韦林联合干扰素α-2b或者索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗观察3个月。采用ELISA法[7]检测血清CTLA-4、TIPE2和IL-12水平。结果观察组快速病毒学应答(RVR)率为88.9%,显著高于对照组(43.1%,P<0.05),早期病毒学应答(EVR)率为90.7%,显著高于对照组(52.9%,P<0.05),治疗结束时应答率为96.3%,显著高于对照组(76.5%,P<0.05),持续病毒学应答(SVR)率为92.6%,显著高于对照组(60.8%,P<0.05);外周血白细胞水平为(5.2±2.0)×10^9/L,显著高于对照组【(3.4±1.8)×10^9/L,P<0.05】,红细胞水平为(4.9±0.5)×10^9/L,显著高于对照组【(4.6±0.7)×10^9/L,P<0.05】,血小板计数为(113.2±38.6)×10^9/L,显著高于对照组【(94.7±41.2)×10^9/L,P<0.05】;血清CTLA-4水平为(1.1±0.4)ng/mL,显著低于对照组【(1.6±0.7)ng/mL,P<0.05】,血清IL-12水平为(29.6±7.3)pg/mL,显著低于对照组【(41.5±11.7)pg/mL,P<0.05】,而血清TIPE2水平为(0.8±0.1)μg/L,显著高于对照组【(0.6±0.3)μg/L,P<0.05】;在治疗期间,观察组不良反应发生率为25.9%,显著低于对照组(94.1%,P<0.05)。结论应用索磷布韦/维帕他韦联合利巴韦林治疗CHC患者疗效好,除强大的抗病毒作用外,可能与该治疗能降低血清CTLA-4和IL-12水平,升高血清TIPE2水平有关。

基于IRAK1-NF-κB通路探讨解毒祛瘀滋阴方干预MRL/lPr狼疮小鼠机制

目的:研究解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr狼疮小鼠及其脾细胞和CD4+T细胞白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK1)信号通路异常活化的影响,探讨解毒祛瘀滋阴方对IRAK1-NF-κB信号通路的作用,为其治疗系统性红斑狼疮(SLE)临床用药提供良好的理论支持。方法:制备解毒祛瘀滋阴方冻干粉,HPLC法检测其有效成分及含量;分离来自MRL/lpr狼疮小鼠的脾脏细胞和CD4+T细胞,流式检测CD4+T细胞的纯度;以LPS诱导细胞,采用CCK8法检测LPS和中药对细胞的活力。将MRL/lpr狼疮小鼠随机分为西药组、中药组和模型组,MRL/Mp小鼠作为对照组,药物干预结束后,HE染色观察肾脏病理改变;RT-qPCR和Western blot技术检测小鼠脾细胞、CD4+T细胞和脾脏IRAK1及下游NF-κB信号通路之间的表达水平。结果:解毒祛瘀滋阴方中检测到有效成分没食子酸、芍药苷、阿魏酸和异阿魏酸;中药组MRL/lpr小鼠的狼疮症状减轻,脾脏IRAK1-NF-κB信号通路的表达水平显著降低(P<0.05)。解毒祛瘀滋阴方冻干粉以100、10、1μg/mL为最佳给药浓度,可降低LPS诱导的IRAK1及其下游蛋白的磷酸化,并抑制IFN-α和IFN-β的表达(P<0.05)。结论:解毒祛瘀滋阴方对MRL/lpr小鼠的狼疮症状有治疗作用,并能通过下调MRL/lpr小鼠及其CD4+T细胞中的IRAK1-NF-κB信号通路,抑制LPS诱导的细胞活化,解毒祛瘀滋阴方治疗SLE作用机制可能是通过调控IRAK1信号通路来实现的。