酵母细胞催化合成18α-甘草酸

18α-甘草酸(18α-GL)是一种齐墩果烷型皂苷,比其差向异构体18β-GL极性小、亲脂性好,更强的抗毒抗炎作用和更高的肝脏靶向性使18α-GL成为保肝护肝领域的主要药物成分。但目前18α-GL的制备方法污染大、效率低,亟需开发一种绿色简单地合成18α-GL的方法。利用酵母细胞异源表达糖基转移酶,通过全细胞催化方式鉴定出可催化18α-甘草次酸(18α-GA)特异性合成18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸(18α-GAMG)的糖基转移酶cGuCSyGT和催化18α-GAMG特异性合成18α-GL的糖基转移酶GgUGT1。进一步运用蛋白质结构预测和分子动力学模拟探究cGuCSyGT对18α-GA的催化活性比18β-GA低的原因。最后采用优化底物添加浓度、底盘细胞、底物添加时间、反应时间、培养基成分补加和底物溶剂的策略构建了酵母催化合成18α-GAMG和18α-GL的最优工艺,使18α-GAMG和18α-GL的产量分别达到(36.38±1.87)mg/L和(39.32±0.75)mg/L。本研究实现了18α-GAMG和18α-GL的微生物催化合成,可为18α-GL的微生物全合成提供理论基础和技术支撑。

18α-甘草酸二铵对大鼠肝脏细胞色素P450和II相酶的影响

目的 研究 18α 甘草酸二铵 (18α GL)对肝脏药物代谢酶的影响。方法 ♂Wistar大鼠ig 18α GL 12 5和 5 0mg·kg-1,分别给药 3 ,6和 12d ,对照组给等容量的溶媒。酶学测定肝微粒体细胞色素P45 0 (CYP) ,尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶 (GT)和谷胱甘肽巯基转移酶 (GST)活性。结果 18α GL抑制苯胺羟化酶 ,乙氧异唑脱乙基酶和红霉素脱甲基酶活性 ,抑制率分别可达 5 3 2 % ,47 3%和 34 3 % ;增加GT1(底物为 7 甲基 4 羟基 香豆素 ) ,GT2 (底物为 4 羟基联苯 )和GST活性 ,分别可达 2 9 9% ,70 3%和 48 3 %。结论 18α GL对大鼠肝微粒体I相酶(CYP2E1,CYP1A1和CYP3A)主要是抑制作用 ,对II相酶 (GT1,GT2 和GST)

18α-甘草酸下调“胶原蛋白凝胶三明治”培养的大鼠肝细胞P450酶活性及mRNA表达

研究 18α 甘草酸 (18α GA)对肝细胞主要细胞色素P4 50 (CYP)药物代谢酶的影响 ,并初步探讨其分子机理 .采用“胶原蛋白凝胶三明治”培养的原代大鼠肝细胞 ,加 18α GA孵育 ,酶学测定CYP1A1(7 乙氧基异口恶唑O 脱乙基酶 ,EROD) ,CYP2E1(苯胺羟化酶 ,ANH)和CYP3A(红霉素N 脱甲基酶 ,ERD)活性 ,逆转录聚合酶链反应测定CYP1A1,CYP2E1和CYP3A1mRNA表达水平 .结果可见 ,18α GA浓度依赖性 (50～ 4 0 0mg·L- 1)抑制大鼠肝细胞EROD ,ANH和ERD活性 ,2 0 0mg·L- 1作用最强 ,抑制率分别可达 59.6 % ,6 9.7%和 4 4 .7% ,且呈时间依赖性 ,于d 4达高峰 ;浓度依赖性 (50～ 2 0 0mg·L- 1)抑制CYP1A1,CYP2E1和CYP3A1mRNA表达水平 ,分别可达 4 4 .5% ,58.1%和 37.0 % .上述结果表明 18α GA在转录水平下调大鼠肝细胞CYP1A1。

18α-甘草酸二铵与格列本脲联用对实验性糖尿病大鼠糖代谢的影响及其机制

目的探讨18α-甘草酸二铵(DG)是否影响格列本脲(Gli)的代谢及降糖效应,联用的效应及其机制。方法观察DG(25mg·kg-1·d-1,ip,×5d)及与Gli(1mg·kg-1·d-1,ig,×5d)联用对实验性糖尿病大鼠空腹血糖、血浆胰岛素、胰岛素敏感性指数、肝糖原及CYP3A活性的影响。免疫组化方法观察胰岛及B细胞形态结构变化,定量分析胰岛素表达水平。结果与模型组相比,DG与Gli联用比单用Gli进一步降低空腹血糖,上调胰岛素及肝糖原水平。DG单用或联用Gli均抑制CYP3A活性并下调肝损伤指标。DG联用Gli时,随CYP3A活性下降,胰岛素及空腹血糖下降率均提高。免疫组化显示,DG可进一步改善Gli对胰岛及B细胞形态结构的影响,并使胰岛素分泌增加。结论DG可增强Gli降糖效应,其机制可能与其抑制CYP3A活性,使Gli代谢延缓,致使降糖效应增强并与其促进胰岛B细胞修复和再生有关,提示DG有作为口服降糖药辅助用药的可能性。

18α-甘草酸抗大鼠肝纤维化实验研究

目的 :研究18α -甘草酸及γ -干扰素的抗肝纤维化作用。方法 :以二甲基亚硝胺腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型 ,染毒开始及染毒后5wk分别用18α -甘草酸和γ -干扰素预治疗和治疗肝纤维化。并与正常组比较 ,观察各组病理变化及肝纤维化程度。结果 :18α -甘草酸预治疗组和治疗组肝纤维化程度均与γ -干扰素组相近 (P>0 05) ,且治疗组肝纤维化程度明显小于染毒对照组(P<0 05) ,其肝羟脯氨酸、血清透明质酸水平较染毒组明显降低。结论 :18α -甘草酸有较好的抗肝纤维化作用。

18α-甘草酸和18β-甘草酸抗大鼠肝纤维化作用比较研究

目的以γ-干扰素(IFN-γ)为阳性对照药,比较研究18α-甘草酸(18α-GL)、18β-甘草酸(18β-GL)的抗大鼠肝纤维化作用。方法以二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射诱导大鼠肝纤维化模型,染毒开始及染毒后5周分别用18-αGL,18-βGL,IFN-γ预治疗和治疗肝纤维化。观察各组肝羟脯氨酸(HyP)、血清透明质酸(HA)水平,血清生化指标、病理及肝纤维化程度。结果与IFN-γ比较,18-αGL,18β-GL差相异构体预治疗组和治疗组抗肝纤维化作用与其相近,治疗组明显优于染毒对照组;18α-GL治疗组明显优于18β-GL组。结论18-αGL,18β-GL差相异构体有较好的抗肝纤维化作用,且18α-GL明显优于18β-GL。

18α-甘草酸二铵对格列本脲在实验性糖尿病大鼠体内药动学的影响

目的探讨在实验性糖尿病大鼠体内联用18α-甘草酸二铵(DG)和格列本脲(Gli)时,DG对Gli药动学的影响。方法采用RP-HPLC测定实验性糖尿病大鼠单用Gli及与DG联用后Gli的血药浓度。用DAS软件进行药动学分析,比较两组Gli药动学参数的变化。结果DG与Gli联用后,Gli的Ke值较单用时明显减少(P＜0.01),而ρ_(max),AUC_(0-∞)和t_(1/2(Ke))则显著增加(P＜0.01)。其余各药动参数差异无显著性。结论DG可抑制Gli的代谢,使其进入血循环总量增加,消除延缓,但不影响Gli的吸收。提示两药联用时应注意调整剂量,避免不良反应发生。

高效液相色谱法对甘利欣注射液中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量测定

目的:用RP-HPLC法测定甘利欣注射液中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。方法:采用ZOR-BAX Extend C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm);乙腈-磷酸盐缓冲液(pH=7:20:80)为流动相;检测波长250nm;流速1mL.min-1;柱温为30℃。取混合对照品溶液及供试品溶液,分别注入液相色谱仪,以混合对照品溶液色谱图中18α-甘草酸和18β-甘草酸的峰面积(3次平均)外标法计算甘利欣中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。结果:18α-甘草酸和18β-甘草酸分别在0.1010～1.0100μg(r=0.99984)和0.1033～1.0330μg(r=0.99948)范围内呈线性;18α-甘草酸和18β-甘草酸加样回收率和RSD分别为98.02%、RSD=0.35%和97.5%、RSD=0.54%。结论:对于提高甘利欣注射液药品质量标准,该方法更加简便、可靠、准确,具有定性、定量双重意义。

12产地甘草中18α-甘草酸及18β-甘草酸的含量分析

目的：分析不同产地甘草中18α-甘草酸及18β-甘草酸的含量差异,为不同产地甘草的质量评价提供参考。方法：采集7个省区12个不同产地的甘草种子,栽培于北京中医药大学药草园,一年后以其中180株甘草作为实验材料,利用内转录间隔区（ITS）序列鉴定其基原,采用高效液相色谱（HPLC）法测定其18α-甘草酸及18β-甘草酸含量,并分析其差异性及相关性。结果：ITS鉴定结果显示180株甘草样品均为乌拉尔甘草。HPLC分析结果显示,18α-甘草酸的标准曲线为y=6×10-7x-0.0029（R2=0.9982）,在0.0111~0.2214μg范围内线性良好;18β-甘草酸的标准曲线为y=1×10-6x＋0.0164（R2=0.9999）,在0.2256~4.5120μg范围内线性良好。12个产地中山西应县甘草样品的18α-甘草酸及18β-甘草酸含量均最高,新疆尼勒克县甘草样品的18α-甘草酸及18β-甘草酸含量均最低,且所有样品中18α-甘草酸与18β-甘草酸的含量均存在显著相关关系。结论：不同产地甘草质量差异显著,本实验结果可为不同产地甘草的质量评价提供参考。

18α-甘草酸保肝药理作用研究近况

18α-甘草酸(甘草酸二铵,18α-GL)是通常所说的甘草酸(即18β-甘草酸,18β-GL)的差向异构体。18α-GL对急、慢性免疫性肝损伤以及多种化学性肝损伤动物模型均具有显著的保护肝脏作用。但从目前动物实验研究资料分析,尚不足以判定18α-GL的保肝作用强于18β-GL。该文综述了近年来18α-GL在体内外动物实验模型中抗急、慢性肝损伤作用以及与18β-GL保肝作用的比较等方面的研究近况。

18α-甘草酸二铵对格列本脲在实验性糖尿病大鼠体内药动学及药效学的影响及其机制

目的 探讨在实验性糖尿病大鼠体内联用18α-甘草酸二铵（DG）和格列本脲（Gli）时，DG对Gli药代动力学及其降糖效应的影响，同时阐明其机制。方法 采用四氧嘧啶诱发糖尿病大鼠模型。观察Gli（1mg·kg^-1·d^-1ig）×5d及与DG（25mg·kg^-1·d^-1ip）×5d联用后，实验性糖尿病大鼠血浆中Gli药代动力学的变化。同时测定空腹血糖、血浆胰岛素、胰岛素敏感性指数、肝糖原和CYP3A活性。通过免疫组织化学和图象分析的方法观察胰岛及B细胞形态结构的变化，并对胰岛素的表达进行定量分析。

高效液相色谱法同时测定中国不同产地甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸含量的研究

甘草作为我国传统医学组方中常用药物的历史非常悠久，我国传统医学认为甘草的干燥根或根茎具有益气补脾、解毒去热、止咳祛痰、止痛缓急、调和诸药的功效。甘草中起到药理作用的甘草酸包括18α‐甘草酸和18β‐甘草酸，二者在甘草中同时存在且互为反向异构体，18α‐甘草酸和18β‐甘草酸均具有不同程度的抗炎、抗过敏、保肝、抗纤维化、类固醇样等药理作用［1，2］。我国传统医学对中草药特别注重产地，不同产地的甘草中甘草酸的含量也是有比较大的差异。品优质高的甘草主要分布于我国的内蒙、新疆和宁夏。为了能选择品优质高的甘草药材，笔者采用高效液相色谱法（HPLC法）在同一色谱条件下同时测定我国不同甘草主产地所产甘草中18α‐甘草酸和18β‐甘草酸的含量，试验结果可为选择药品生产中甘草药材的质量评价提供参考。

HPLC法同时测定甘草酸二铵原料中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量

目的：建立HPLC法同时测定甘草酸二铵原料中差向异构体18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。方法：色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm,5μm）;流动相：水相（水-60%高氯酸溶液为48∶0.5,用氨水调节p H至8.0）-甲醇（48∶52）;检测波长：248 nm;流速：1.0 ml·min-1;柱温：30℃;进样量：20μl。结果：18α-甘草酸和18β-甘草酸得到良好分离;线性范围均为0.005 0~1.000 0 mg·ml-1（r分别为0.999 7和0.999 3）;平均回收率分别为99.7%和99.1%,RSD分别为0.9%和0.4%（n=9）。结论：该法专属性强,准确度高,可用作甘草酸二铵原料中差向异构体的含量测定。

18β-甘草酸和18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞CYP3A酶表达的影响

目的:研究甘草中的2种成分18β-甘草酸和18α-甘草酸对原代培养大鼠肝细胞中细胞色素P450 3A(CYP3A)在mRNA及蛋白水平表达的影响,并探讨其剂量-效应关系。方法:原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞并采用"胶原蛋白凝胶三明治"培养原代肝细胞,无血清条件下培养细胞,并用不同剂量的18β-甘草酸和18α-甘草酸处理细胞,RT-PCR法测定CYP3A mRNA表达水平,Western-blot法测定CYP3A蛋白表达。结果:实验条件下对照组、18β-甘草酸、18α-甘草酸处理组CYP3A基因及蛋白均可被检测,18β-甘草酸浓度依赖性诱导CYP3A mRNA(25~100μmol.L-1)及蛋白表达(50~400μmol.L-1),而18α-甘草酸浓度依赖性抑制CYP3A mRNA(25~100μmol.L-1)及蛋白表达(25~100μmol.L-1)表达。结论:18β-甘草酸和18α-甘草酸在转录水平上分别上调和下调大鼠肝细胞CYP3A的表达。

18α-、18β-甘草酸对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及其联合用药的研究

目的对比研究18α-甘草酸与18β-甘草酸对免疫性肝损伤小鼠的保护作用,并筛选二者联合用药的最佳配伍比例。方法采用刀豆蛋白A(Con A)诱导小鼠免疫性肝损伤模型,观察18α-和18β-甘草酸高、中、低剂量组,以及二者联合用药不同配伍比例组对肝损伤小鼠的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、一氧化氮(NO)活性及其各脏器指数的影响,并检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的含量,同时筛选二者联合用药的最佳配伍比例。结果与模型组比较,18α-和18β-甘草酸组均可降低小鼠血清中AST及肝匀浆中AST、ALT、NO活力,降低肝匀浆中TNF-α、IFN-γ的含量,改善小鼠肝脏、胸腺指数;比较二者对免疫性肝损伤小鼠的保护作用,差异无统计学意义;二者联合用药的最佳配伍比例为1∶4,其对肝匀浆中AST、ALT、NO水平的影响优于单用18α-、18β-甘草酸治疗组。结论 18α-和18β-甘草酸对小鼠免疫性肝损伤均有保护作用,二者联合用药的最佳配伍比例为1∶4,其对转氨酶及NO水平的影响优于单用18α-或18β-甘草酸。

18α、18β-甘草酸及其不同配比物对CCl_4肝损伤大鼠的影响

目的:研究不同配比的18α、18β-甘草酸(GL)对四氯化碳(CCl4)肝损伤大鼠的保护作用,探讨临床应用合理比例。方法取健康雄性SD大鼠(200±20)g 70只,随机分为7组,即正常组、CCl4肝损伤组、18α-GL、18β-GL和3个不同配比组(α:β比例分别为4∶6、3∶7和2∶8)。采用腹腔注射CCl4复制大鼠急性肝损伤模型。分别于24h和48h后摘眼球取血,测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,同时测定肝脾重量,肝脏超氧化物歧化酶(SOD),并对肝细胞的组织形态学进行观察。结果:模型组大鼠ALT、AST、肝脏系数显著增高,脾脏系数和SOD活性显著降低,组织病理学亦有显著差异,造模成功。5个药物组中以18α-和18β-GL配比为3∶7最佳,能显著抑制CCl4引起的大鼠血清ALT、AST及肝脏系数的升高以及脾脏系数和肝脏SOD活性的降低,并能显著减轻CCl4引起的肝细胞组织病理学改变。结论:18α-与18β-GL 3∶7配比组对CCl4致大鼠肝损伤具有较强的保护作用。

甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响

研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响,选择最佳浓度比例.建立细胞模型,选择甘草酸总浓度为1∶10∶30∶60∶120∶240μmol/L,18α-Gly与18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10,根据细胞存活率,选择合适浓度比例,利用流式细胞仪测定细胞内荧光强度,寻找荧光强度最大的浓度比,即对P-gp抑制作用最强,P-gp功能最弱.研究结果表明甘草酸总浓度为1μmol/L时,随着18α-Gly比例的减少,荧光强度逐渐减弱,P-gp诱导作用逐渐增加.甘草酸总浓度为10μmol/L和60μmol/L时,随着两者物质的量比的变化,荧光强度变化明显;当总浓度为10μmol/L,n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时,荧光强度较强,抑制作用明显;当总浓度为60μmol/L,两者物质的量比为5∶5时荧光强度最强,抑制作用最强.

反相高效液相色谱法测定甘草酸18H-差向异构体含量

目的建立同时测定18α-甘草酸和18β-甘草酸的反相高效液相色谱法。方法色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)-乙腈(80:20),流速1.0mL/min,柱温30℃,检测波长250nm。结果18α-甘草酸和18β-甘草酸达到基线分离,两者的进样量在1.0～2.0μg范围内与峰面积线性关系良好,r=0.9998(n=6),平均回收率分别为99.58%和99.94%,RSD分别为0.54%和0.28%(n=9)。结论所用方法简便、快速,可同时测定18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量。

18α-甘草酸和18β-甘草酸差向异构体的比较研究概况

甘草酸是甘草中含量最高且具有广泛生物活性的有效成分,虽然18α-甘草酸与18β-甘草酸分子式相同仅存在18位H的构相差异,其性质却不同。本文对两者物理化学性质、药理作用及毒性、不良反应等的比较研究现状做一综述。

整体化色谱柱分离测定甘草酸18H-差向异构体

建立整体化色谱柱分离分析甘草酸18H-差向异构体的方法。采用C18整体化色谱柱,流动相为磷酸盐缓冲液-乙腈体系,探讨了磷酸盐缓冲液pH及浓度、乙腈含量、柱温等对甘草酸18H-差向异构体分离的影响,在优化色谱条件下,18α-、18β-甘草酸得到基线分离,分离度可达2.75,二异构体出峰时间在10 min内,且在2.12～21.2μg/mL范围内线性关系良好。运用整体化色谱柱缩短了甘草酸18H-差向异构体的分析时间,提高了分析效率,方法可运用于评价甘草酸的异构化及质量控制。