ERK1/2信号通路基因3'UTR多态性与非小细胞肺癌的相关性

目的探究4个ERK1/2信号通路的基因3'UTR区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(MAPK1基因中的rs9340,NRAS基因中的rs14804,KRAS基因中的rs712和rs7973450)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的相关性。方法纳入了478名NSCLC患者及480名健康对照者,利用TaqMan探针法对其进行基因分型检测,并分析上述4个SNP与NSCLC的相关性。结果rs9340位点的等位基因在对照组与非小细胞鳞状细胞癌组(squamous cell carcinoma,SCC)中分布频率的差异具有统计学意义(P=0.009),该结果表明rs9340位点的G等位基因可能是非小细胞肺鳞癌的保护性因素(OR=0.67,95%CI:0.50~0.91)。同时,在<50岁年龄组中,rs9340位点的等位基因在对照组和NSCLC组中的分布频率差异具有统计学意义(P=5.07×10^(-4)),该结果表明rs9340等位基因G可能是NSCLC的保护性因素(OR=0.46,95%CI:0.29~0.72)。结论MAPK1基因SNP位点rs9340可能与NSCLC的发生风险相关。

一个类黄酮3'-羟化酶参与多星韭花色素生物合成的功能解析

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)在花色素苷生物合成过程中起关键作用。明确多星韭F3'H在花色素苷生物合成中的功能,将为多星韭花色形成及改良研究提供基因资源。基于转录组数据从多星韭花朵中克隆获得AwF3'H,并对其进行生物信息学分析,利用Real time PCR对AwF3'H1的表达模式进行分析,并利用蘸花法将AwF3'H转入拟南芥中,同时对转基因植株进行表型观察及花色素苷检测分析。结果表明,Aw F3'H的ORF全长为1545 bp,编码514个氨基酸,属于细胞色素P450家族成员,与洋葱AcF3'H的亲缘关系最近;在所检测组织均有表达,但在雄蕊中表达最高,根中表达最低;与野生型拟南芥相比,转AwF3'H拟南芥T2代幼苗子叶及下胚轴颜色明显加深,矢车菊素与天竺葵素类花色苷积累量显著增加。表明AwF3'H具有类黄酮3'-羟化酶的功能。

Pd-有机膦催化Suzuki偶联合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯

以3,4-二氯苯硼酸和2-溴-4-氟苯胺为原料,在碱性条件下使用Pd-有机膦复合催化剂进行Suzuki偶联反应,经分液、减压浓缩得到2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯。通过对不同反应条件进行优化,获得优化条件为:以甲苯和水为混合溶剂,n(2-溴-4-氟苯胺)∶n(3,4-二氯苯硼酸)∶n(K_(2)CO_(3))∶n(复合催化剂)=1∶1.2∶1.2∶0.0005,反应温度85℃,反应时间4h,产物纯度98.0%,收率大于97.0%。该方法催化剂用量少、工艺简单、产品收率高,符合绿色化学生产理念,具有工业化前景。

基于微通道技术合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯

2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯是琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂—联苯吡菌胺的重要中间体。基于微通道技术,以3,4-二氯苯胺为原料,经重氮化、中和、与对氟苯胺偶联得到2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯。系统考察了影响重氮化、中和、偶联3步对反应的影响,并得出优化条件:盐酸与3,4-二氯苯胺当量6:1,亚硝酸钠与3,4-二氯苯胺当量1.1︰1,成盐反应温度60℃,重氮反应温度25℃,氢氧化钠当量6.5︰1,中和温度25℃,偶联最佳温度120℃,对氟苯胺当量10︰1。在此优化条件下合成2-氨基-5-氟-3',4'-二氯联苯粗品含量85%,精制后含量可以达到98.5%,2步总收率65%。

3,3',4,4'-四氨基二苯醚的合成及其聚苯并咪唑树脂的制备

以4,4'-二氨基二苯醚为原料,经乙酰化、硝化、碱解、还原、中和五步反应合成3,3',4,4'-四氨基二苯醚,总收率为52.8%,并用FT-IR及熔点测试技术对其进行了表征。结果表明,3,3',4,4'-四氨基二苯醚具有较高的纯度,在多聚磷酸与五氧化二磷的体系下,进一步与二酸聚合可获得高分子量的聚苯并咪唑。有望在未来兴起的燃料电池膜制作领域具有广阔的应用前景。

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列。该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1373bp,与已知NHX1序列同源性最大为80%,其编码区1094bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)长度为239 bp。3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97%、45.63%和40.64%,明显低于编码区的同源性。结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础。

比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

烟草花叶病毒蚕豆株系外壳蛋白基因及3'端非编码区的克隆与序列分析

根据烟草花叶病毒（Ｔｏｂａｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）Ｕ１株系（ＴＭＶ－Ｕ１）序列，人工合成引物，用ＲＴ法合成ｃＤＮＡ后，通过ＰＣＲ技术扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３＇端非编码区。ＤＮＡ序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４８０个碱基，编码１５８个氨基酸，３＇端非编码区全长２０４个碱基，与ＴＭＶ－Ｕ１株系的同源率为１００％。将ＣＰ基因及３＇端非编码区插入ｐＧＥＭＥＸ－１的Ｔ７基因１０中，转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异的蛋白带，Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫检测证明，该特异带与ＴＭＶ抗血清呈阳性反应。

黄草乌Av-F3'5'H基因的克隆与表达分析

根据已发表的川乌头F3'5'H基因序列,通过RT-PCR方法从黄草乌(Aconitum vilmorinianum)花朵中克隆到了1个类黄酮3',5'羟基化酶(F3’5’H)基因的c DNA序列,该序列长1563 bp,包含1个编码506个氨基酸的完整开放阅读框,命名为Av-F3'5'H(Gen Bank登录号:JQ806761)。序列比对分析显示Av-F3'5'H蛋白与其它物种的F3'5'H蛋白序列有很高的序列相似性,包含有已确定的CYP基序、I螺旋区和血红素结合区等保守基序等。以川乌头18sRNA基因(FJ748878)为内参,通过RT-PCR对Av-F3'5'H基因的时空表达模式进行了分析,结果显示Av-F3'5'H基因的表达水平随花朵发育进程而呈递增趋势,在第3时期的花朵中达到最高,随后又逐渐降低,而在根、茎和叶中均不表达,推测该基因可能在调节黄草乌花朵蓝色形成过程中起重要作用。

新型双呋咱并[3,4-b∶3',4'-f]氧化呋咱并[3″,4″-d]氧杂环庚三烯的合成与量子化学研究

以3,4-双(4'-硝基呋咱-3'-基)氧化呋咱为原料,设计并合成了新型双呋咱并[3,4-b∶3',4'-f]氧化呋咱并[3″,4″-d]氧杂环庚三烯(1),收率50.1%,其结构经13C NMR,15N NMR,IR,MS和元素分析表征。最佳的反应条件为:以无水碳酸钠为催化剂,乙腈(含水量0.04%)为溶剂,于80℃反应3.5 h。用B3LYP方法在6-31G**基组水平上对1的结构进行了计算,得到了稳定的几何构型和键级。在振动分析的基础上求得体系在不同温度下的热力学性质,得到了温度对热力学性能影响的关系式。1的性能研究表明,1的m.p.92℃～94℃,爆速8 256m.s-1(1.85 g.cm-3),摩擦感度0%(90°摆角),撞击感度12%(10 kg,25 cm),特性落高H50=57.5 cm(5 kg)。

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株3'端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3'端非编码区(3'UTR)的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3'UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3'UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3'UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低(54.4%～75.5%);3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3'UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。

TLR4基因3'未翻译区G11367C与IκB-α Hae Ⅲ位点多态性的交互作用和急性胰腺炎及其严重程度的关系

目的:探讨Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)基因3'未翻译区G11367C与NF-κB抑制因子(nuclear factor kappa B,IκB)-αHae III位点多态性的交互作用和急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)及其严重程度的关系。方法:选择新乡医学院第一附属医院2013年5月至2015年6月收治的AP患者450例(AP组),AP组又分为轻度AP组(MAP亚组)、中度AP组(MSAP亚组)和重度AP组(SAP亚组)各150例,以150例健康体检者作为对照组。以上述各组患者的外周血白细胞为样本,利用PCR技术检测TLR4基因3'未翻译区G11367C和IκB-αHae III多态性。每位研究对象进行面对面的问卷调查,采用非条件logistic回归对资料进行分析,估算G11367C和IκB-αHae III多态性与AP发病风险的调整比值比(OR)及95%可信区间(95%CI),并分析G11367C与IκB-αHae III多态性的交互作用。结果:G11367C(GC),IκB-αHae III(AG)和IκB-αHae III(GG)基因型频率AP组的分布分别为69.56%,33.78%和36.22%;MAP亚组分别为49.33%,24.67%和26.00%;MSAP亚组分别为70.67%,34.67%和36.67%;SAP亚组分别为88.67%,42.00%和46.00%;对照组分别为26.67%,14.00%和14.67%;上述基因型频率在AP组与对照组之间以及各AP亚组之间差异均有统计学意义(均P<0.01)。G11367C(GC)基因型者患AP的风险均显著增加(ORAP=6.2828,ORMAP=2.6776,ORMSAP=6.6250,ORSAP=21.5147),IκB-αHae III(AG)和IκB-αHae III(GG)基因型者患AP的风险也显著增加(分别ORAP=5.7369,ORMAP=2.5277,ORMSAP=6.1824,ORSAP=17.85751;ORAP=5.8724,ORMAP=2.5902,ORMSAP=6.4027,ORSAP=18.9022)。基因突变的协同分析发现:G11367C(GC)/IκB-αHae III(GG)基因型者频率在AP组、MAP亚组、MSAP亚组、SAP亚组和对照组的分布频率分别为26.44%,12.67%,26.00%,40.67%和4.00%,AP与对照组之间以及各AP亚组之间差异均有统计学意义(均P<0.01)。G11367C(GC)/IκB-αHae III(GG)基因型者患AP的风险显著增加(ORAP=30.1314,ORMAP=6.7612,ORMSAP=39.5000,ORSAP=401.5833),G11367C(GC)与IκB-αHae III(GG)基因型在AP发生、发展存在正向的交互作用(均γ>1),另外在G11367C(GC)和IκB-αHae III(AG)之间也存在正向交互作用(均γ>1)。结论:携带G11367C(GC),IκB-αHae III(AG)和IκB-αHae III(GG)基因型的个体属AP高危险人群,基因型多态性的交互作用促进了AP的发生和发展。

3″,3″-二甲基吡喃[3',4']2,4,2'-三羟基查尔酮的首次全合成

以2,4-二羟基苯乙酮和2,4-二羟基苯甲醛为起始原料,经过C-异戊烯基化、保护酚羟基、羟醛缩合、去保护基反应首次成功地完成了天然产物3″,3″-二甲基吡喃[3',4']2,4,2'-三羟基查尔酮的全合成,总产率18.4%,其结构经1H NMR,IR和MS表征。中间体8未见文献报道。

瓜叶菊F3'5'H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3',5'-羟羟基花青素(飞燕草色素及其衍生物)的相对含量较高,类黄酮-3',5'-羟基化酶(F3'5'H)是合成这类色素的关键酶。不同物种F3'5'H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据。瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等。根据已知F3'5'H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列。设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3'5'H同源基因(PCFH)。cDNA全长1660bp,编码505个氨基酸。序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、I螺旋区和膜插入点的信号序列等。与其它物种的F3'5'H基因的序列相似性也较高。与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%。序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族。利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础。

3,4-双(3'-氨基呋咱-4'-基)呋咱的合成与表征

以3-氨基-4-酰氯肟基呋咱(AAOF)为原料,经分子间二聚生成3,4-二氨基呋咱基氧化呋咱(DATF),DATF还原生成了新化合物3,4-双(3'-氨基呋咱-4'-基)呋咱(BATF),总收率为54%,采用红外光谱、核磁共振光谱、质谱、元素分等进行了结构表征。通过质谱裂解碎片,研究了BATF的碎裂反应机理;探讨了还原反应关键影响因素,确定了最佳的反应条件为:还原剂为SnC l2/HC l/AcO H,料比n(还原剂)n(DAT F)为31～41,反应温度为75℃,时间为7 h。

新环3-甲基-1-苯基-6-芳基偶氮-7-羟基双吡唑[5,1-c:3',4'-e]并-1,2,4-三嗪的合成

为进一步研发抑制细胞分裂周期磷酸酯酶CDC25B的抗肿瘤药物,以3-氨基-5-吡唑啉酮为原料,合成了8个新的标题化合物。通过元素分析、IR和1HNMR确证所得化合物的结构,并且确定其中有3个化合物对CDC25B具有较好的抑制活性。

TBX2基因3'非翻译区位点rs59382073与汉族人群散发型先天性心脏病的易感性密切相关

目的分析TBX2基因3＇UTR变异位点与汉族人群散发型先天性心脏病（CHD）的遗传易感性是否关联,初步探讨其可能的发病机制。方法纳入2010年8月至2012年4月山东济南军区总医院心血管病研究所诊断的非综合征型汉族CHD为CHD组,以同期医院和社区体检的健康儿童为对照组。选择CHD组和对照组各24例行TBX2 3＇UTR测序。根据测序结果在CHD组和对照组分别行SNa Pshot基因分型和关联分析;通过细胞转染及荧光素酶检测对阳性位点进行功能分析。结果 CHD组纳入768例,年龄（6.1±4.8）岁,男383例（49.9%）;对照组纳入660例,年龄（6.5±3.2）岁,男354例（53.6%）。124例CHD和24例对照行TBX2基因3＇UTR区测序发现3个已知的SNPs位点：rs59382073、rs1058004和rs729782,未检出新发SNPs位点。2样本采集中期CHD和对照组各288例样本的关联分析显示,rs59382073的基因型在CHD组和对照组的分布差异有统计学意义（P=0.012）;余2个SNPs在两组间差异无统计学意义（P〉0.5）,后续样本未行该2个SNPs检测。3全样本关联分析显示,TBX2 3＇UTR rs59382073位点与散发型CHD的患病风险密切相关,GT/TT基因型较GG基因型可导致CHD的患病风险增加2.13倍（OR=2.13,95%CI：1.51~2.99,P=1.44×10-5）;进一步分层分析显示,与GG基因型相比,GT/TT基因型增加2.75倍圆椎动脉干畸形（OR=2.75,95%CI：1.57~4.81,P=3.99×10-4）、3.18倍法洛四联症（OR=3.18,95%CI：1.53~6.61,P=1.90×10-3）和1.70倍室间隔缺损（OR=1.70,95%CI：1.17~2.46,P=5.14×10-3）的患病风险。4细胞水平的功能研究提示,与G等位基因相比,转染T等位基因可分别导致HEK293 T及H9C2细胞的荧光素酶活性下降29.2%和33.6%。结论 TBX2 3＇UTR rs59382073位点可显著增加汉族人群散发型CHD的患病风险;其不同等位基因的荧光素酶表达水平存在差异,为潜在的功能位点。

2',3'-二脱氧-2',3'-二去氢鸟嘌呤核苷构象稳定性的理论研究

采用密度泛函方法在B3LYP/6-31+G**水平上研究了2',3'-二脱氧-2',3'-二去氢鸟嘌呤核苷分子(D4G)的构象.分别研究在气相中的孤立分子和一水合物异构体的相对稳定性和异构体之间的相互转变过程,分析了水分子的参与对D4G异构体的相对稳定性和几何结构参数以及自然电荷的影响.结果表明,孤立的D4G分子在气相中存在8种稳定构象,其中构象d4g-2是所有构象中最稳定的,气相中D4G主要以d4g-2存在.气相中各构象的相对稳定性为:d4g-2>d4g-1>d4g-5>d4g-3>d4g-6>d4g-4>d4g-8>d4g-7.计算得到的各构象键长和键角数据与实验值接近.一个水分子的加入对D4G分子的构型参数有所影响,基本不改变D4G分子各构象的稳定性顺序,但构象转变的能垒有所提高.氢键在分子构象中发挥了重要作用.

3'-大豆苷元磺酸钠对豚鼠离体右心房自律性及收缩特性的影响

目的研究3'-大豆苷元磺酸钠对豚鼠离体右心房自律性及收缩特性的影响,并探讨其作用机制。方法采用豚鼠离体右心房测定3'-大豆苷元磺酸钠对其自律性、收缩幅度、收缩速度、舒张速度的影响。结果3'-大豆苷元磺酸钠可降低豚鼠离体右心房的自律性,明显降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度,且具有明显的剂量依赖性。结论3'-大豆苷元磺酸钠可抑制豚鼠离体右心房的自律性,明显降低豚鼠离体右心房的收缩幅度、收缩速度、舒张速度,且具有明显的剂量依赖性。其作用机制可能与阻断电压依赖性Ca2+通道及抑制肌浆网对Ca2+的释放有关。

胰岛素样生长因子2受体基因3'非翻译区的单核苷酸多态性及其生物信息学分析

目的基因3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)中miRNA结合区域的遗传突变能够影响基因的表达调控,文中利用生物信息学技术预测胰岛素样生长因子2受体(insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R)基因3'UTR的遗传突变,并检测其对基因表达的影响。方法运用多个在线数据库,获取IGF2R基因3'UTR中具有最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs),计算其在不同人种中的频率分布及各SNPs之间的连锁不平衡,并预测与其相应结合的miRNA。最后,检测在淋巴母细胞系中不同变体基因型对IGF2R基因mRNA表达的影响。结果在IGF2R基因3'UTR的33个SNPs中,仅有5个SNPs(rs8191959、rs200237825、rs3832385、rs201568808、rs1050015)具有>0.05的MAF,其中只有rs1050015基因型突变对mRNA表达水平差异具有统计学意义(P=0.010)。结论IGF2R基因3'UTR的rs1050015突变能够促进其表达,可作为帮助预测癌症风险的遗传标志物及个体化治疗的潜在靶点。