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SOCS3基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定
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作者 刘晓梅 庞蓉蓉 +3 位作者 赵聃 李妍 单锴 王迎伟 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2012年第4期307-311,共5页
目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3'端非翻译区(3'-un-translated region,3'-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,并通... 目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3'端非翻译区(3'-un-translated region,3'-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3'-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3'-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。 展开更多
关键词 细胞因子信号抑制蛋白-3基因 3'端非翻译区 微小RNA 荧光素酶报告载体
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3′端非翻译区影响TNFα cDNA在大肠杆菌中的表达 被引量:1
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作者 常金丽 蔡武城 +2 位作者 徐立峰 李昌本 赵寿元 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 1995年第4期304-309,共6页
采用PCR方法改变了表达构建物pRL-rhTNF中的结构,即去掉rhTNFαcDNA3'端非翻译区序列110bp(命名为pRL-rhTNFα2),转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL-rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3'端非翻译区的pRL-r... 采用PCR方法改变了表达构建物pRL-rhTNF中的结构,即去掉rhTNFαcDNA3'端非翻译区序列110bp(命名为pRL-rhTNFα2),转入大肠杆菌后,观察数个阳性转化子的表达情况,并与原型pRL-rhTNFα的表达进行比较。结果表明,去掉3'端非翻译区的pRL-rhTNFα2能稳定表达rhTNFα,其发酵及纯化产品的生物学特征均等同于原型的,且其表达量比原型的有提高,提示3'端非翻译区序列对表达有影响。3'端非翻译区内存在一个相似于TA的重复序列——TTTA TTA七聚体。这可能是本研究中影响TNFα表达量的原因之一。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子A CDNA 3'端非翻译区 基因工程
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关岭牛MSTN基因3'-UTR与bta-miR-27b的靶向验证
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作者 卢贤君 许厚强 +1 位作者 许家利 阮涌 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1235-1243,共9页
【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端... 【目的】明确关岭牛bta-miR-27b与肌肉生长抑制素基因(MSTN)的结合位点及靶向调控关系,为通过调控miRNA改良关岭牛产肉量提供理论依据,也为贵州地方黄牛分子遗传改良工作提供新的切入点。【方法】通过TargetScan预测牛MSTN基因3'端非翻译区(3'-UTR)的潜在miRNA结合区域及互作miRNA,对比关岭牛与不同关岭牛杂交品种的生理表型及MSTN基因和3'-UTR端miRNA表达差异,并分析bta-miR-27b在不同关岭牛杂交群体中的靶位点特异性。将MSTN基因3'-UTR序列野生型(WT)和3'-UTR序列突变型(MUT)分别克隆至pMIR-REPORT Luciferase(H306)载体构建重组双荧光素酶报告基因载体,与bta-miR-27b共转染293T细胞以验证bta-miR-27b与MSTN基因的作用关系,并利用实时荧光定量PCR验证bta-miR-27b对MSTN基因表达的影响。【结果】在牛MSTN基因3'-UTR端发现7个miRNA结合位点;关岭牛各系杂交品种的3个miRNA(bta-miR-27a-3p、bta-miR-27b和bta-miR-128)相对表达量均极显著高于关岭牛(P<0.01,下同),MSTN基因相对表达量极显著低于关岭牛,体质量、体高、体斜长、胸围等生长指标却明显优于关岭牛。关岭牛及其杂交牛MSTN基因3'-UTR端的bta-miR-27b结合区域均无突变、无缺失;MSTN-3'-UTR(WT)与bta-miR-27bmimics共转染293T细胞后其相对荧光值下降53.80%,极显著低于MSTN-3'-UTR(MUT)+bta-miR-27bmimics共转染;转染bta-miR-27b mimics后,bta-miR-27b在关岭牛原代成肌细胞株(N2)中成功超表达,而MSTN基因相对表达量呈极显著下调趋势,表明bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。【结论】bta-miR-27b与MSTN基因的结合区域位于3'-UTR端第62~69位碱基处,且靶位点保守性较高。bta-miR-27b对MSTN基因有很强的靶向调控作用,表现为bta-miR-27b能抑制MSTN基因表达。 展开更多
关键词 关岭牛 MSTN基因 3'端非翻译区(3'-UTR) bta-miR-27b 双荧光靶向验证
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AKT2 3'-UTR荧光素酶报告基因载体构建及与miRNA-625靶向关系验证 被引量:3
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作者 魏斌 邓霞 +1 位作者 卞秀娟 钱粉红 《江苏大学学报(医学版)》 CAS 2016年第3期204-207,共4页
目的:通过构建荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系。方法:通过生物信息学软件预测AKT2为miRNA-625靶基因;构建野生型AKT2基因3'端非翻译区荧光素酶报告基因载体及miRNA-625靶序列突变型载体;将HEK-293... 目的:通过构建荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系。方法:通过生物信息学软件预测AKT2为miRNA-625靶基因;构建野生型AKT2基因3'端非翻译区荧光素酶报告基因载体及miRNA-625靶序列突变型载体;将HEK-293T细胞株随机分为野生型+miRNA-625组、野生型+miRNA内参组、突变型+miRNA-625组、突变型+miRNA内参组;Lipofectamine 2000转染相应的质粒与miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:构建野生型及突变型荧光素酶报告载体鉴定正确,双荧光素酶报告基因检测系统显示野生型+miRNA-625组相对荧光素酶活性较野生型+miRNA内参组明显降低(t=14.176 4,P<0.05)。结论:miRNA-625对野生型AKT2重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miRNA-625能够靶向调控AKT2基因。 展开更多
关键词 miRNA-625 AKT2基因 荧光素酶报告基因 3'端非翻译区
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家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究 被引量:1
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作者 曹学亮 夏定国 +3 位作者 裘智勇 郭锡杰 沈兴家 赵巧玲 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期455-462,共8页
MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid... MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P<0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。 展开更多
关键词 家蚕核型多角体病毒 miRNA Bm NPV-miR-364 DNA聚合酶基因 3'端非翻译区
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miR-29a靶基因ITGβ_1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响 被引量:1
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作者 崔琳 刘卫红 +2 位作者 高原 王幼平 申意彩 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第17期102-107,共6页
目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素... 目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ_1基因靶向调控的作用。方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成c DNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ_1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p MIR-Report上,构建出p MIR-ITGβ_1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定。将p MIR-Report Luciferase载体,所构建的p MIR-ITGβ_1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ_1的作用机制。结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建p MIR-ITGβ_1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ_1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达。结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达。 展开更多
关键词 野生型及其突变型 荧光素酶报告基因 突变型整合素β1-3'端非翻译区 双荧光素酶报告基因 转录后调控 药物筛选
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Expression and Phylogenetic Analysis of Pea Actin Isoforms 被引量:5
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作者 江元清 赵武玲 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 2002年第12期1456-1461,共6页
Pea ( Pisum sativum Linn.) actin gene family contains at least three isoforms (PEAcⅠ, PEAcⅡand PEAcⅢ), and the DNA sequence of these isoforms show high similarity in the coding regions and significant divergence... Pea ( Pisum sativum Linn.) actin gene family contains at least three isoforms (PEAcⅠ, PEAcⅡand PEAcⅢ), and the DNA sequence of these isoforms show high similarity in the coding regions and significant divergence in the untranslated regions. RT_PCR and Southern blotting using 3′_untranslated region (3′_UTR) as specific probe revealed that pea isoactin genes were expressed in roots, stems, leaves, tendrils, pollen and juvenile siliques, but displayed different patterns of transcript accumulation. Two_fold serial dilution electrophoresis showed PEAcⅠ mRNA preferentially accumulated in rapidly developing tissues: it peaked in seven days' stem; remained at a rather high level in leaves within a month but decreased significantly later; varied a little in tendrils and reached a median and a very low level respectively in juvenile siliques and in pollen. PEAcⅡ displayed somewhat similar expression pattern to PEAcⅠ. The observed differences in sequences and transcript accumulation patterns suggest that the individual pea actin genes may differ in their transcriptional regulation and cellular function. Phylogenetic tree of actins showed that pea actin isoforms are as diverged from each other as they are from other plant actins, and pea actins might have originated from a common ancestor before the divergence of the dicot and monocot plants. 展开更多
关键词 ACTIN 3′_untranslated region (3′_UTR) differential expression molecular evolution pea ( Pisum sativum )
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COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建及其与miR-299靶向关系验证
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作者 令狐熙涛 黄帅 +5 位作者 罗永祥 张云 陈佳瑜 万雪 刘毅 瓦庆德 《中华显微外科杂志》 CSCD 北大核心 2019年第3期258-263,共6页
目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299(miR-299)与Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础.方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3... 目的探讨双荧光素酶报告基因载体构建并鉴定微小RNA-299(miR-299)与Ⅳ型胶原α3链(COL4A3)基因的靶标关系,为miR-299调控COL4A3基因影响干细胞成软骨分化研究奠定基础.方法2018年3月至2018年12月,利用生物信息学方法预测miR-299与COL4A3-3'UTR区(3'端非翻译区)的潜在结合位点,并通过PCR法扩增COL4A3-3'UTR野生和突变序列,将其克隆至psiCHECK-2质粒中构建相应载体,载体鉴定采用酶切法和基因测序法.细胞复苏、扩增并转染,转染分4组,每组3孔,分别为:①COL4A3-WT加miR-299/NC.②COL4A3-WT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor.③COL4A3-MUT加miR-299/NC.④COL4A3-MUT加miR-299-inhibitor/NC-inhibitor;采用双荧光素酶检测试剂盒测定各组荧光素酶活性并行t检验比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义.结果酶切及DNA测序结果显示psiCHECK-2-COL4A3双荧光素酶报告基因载体构建成功.Luciferase检测显示:野生型COL4A3基因组间比较,miR-299转染组(R/F均值为59.38%)较NC组(R/F均值为100%)荧光素酶活性下降,组间差异有统计学意义(P<0.05);野生型COL4A3基因加inhibitor后组间比较,miR-299-inhibitor组(R/F均值为153.98%)较NC-inhibitor组(R/F均值为100%)荧光素酶活性上升,组间差异有统计学意义(P<0.05);突变型COL4A3基因组及突变型组加入inhibitor后组间比较,miR-299转染组(R/F均值为102.09%)及miR-299-inhibitor组(R/F均值为108.51%)较对应NC组(R/F均值为104.70%)及NC-inhibitor组(R/F均值为105.13%)比较,荧光素酶活性差异均无统计学意义(P>0.05).结论COL4A3基因3'UTR双荧光素酶报告基因载体构建成功,并通过双荧光素酶实验进一步验证了miR-299直接作用于靶基因COL4A3-3'UTR区域的真实性. 展开更多
关键词 Ⅳ胶原α3 微小RNA 3'端非翻译区 双荧光素酶报告基因载体 软骨分化
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