急性动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血单核细胞4-1BB配体表达水平的变化

目的研究急性动脉粥样硬化性脑梗死(AC I)患者外周血单核细胞(PBMC)4-1BB配体(4-1BBL)表达水平的变化。方法通过流式细胞术和酶联免疫吸附分析(ELISA)测定20例ACI患者PBMC4-1BBL的表达和血浆可溶性4-1BBL(s4-1BBL)的浓度,并与19例动脉粥样硬化患者及23名健康对照者进行比较,并对部分患者做了连续观察。结果与正常对照组CD14+单核细胞上4-1BBL的阳性细胞率和平均荧光强度(MFI)[(4.6±2.4)%,(4.1±2.7)]和血浆s4-1BBL(75 pg/ml)比较,ACI组[(7.9±4.1)%,(7.0±4.0),133.2 pg/ml]显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),与动脉粥样硬化组阳性细胞率[(6.3±5.0)%]和MFI(5.2±2.3)和血浆s4-1BBL(84 pg/ml)比较差异均无统计学意义;在ACI恢复期4-1BBL的阳性细胞率和MFI分别为(7.6±5.4)%和(5.6±2.1),血浆s4-1BBL水平为113.2 pg/ml,与急性期相比呈下降趋势,但差异无统计学意义。结论 ACI患者4-1BBL的表达上调是ACI发病早期即被诱导产生的一个异常免疫应答,在动脉粥样硬化所致缺血性脑卒中的发病过程中可能发挥着重要的作用。

共刺激分子:4-1BB和4-1BB配体的研究进展

4 1BB和 4 1BB配体 (4 1BBL)属于肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子受体 (TNF TNFR)超家属成员。近年研究发现 ,4 1BB和 4 1BBL相互作用产生的共刺激信号在机体免疫应答 ,如肿瘤免疫、移植免疫等中起重要作用。因此 ,调节 4 1BB 4 1BBL信号有望成为临床治疗恶性肿瘤 (特别是低免疫原性肿瘤 )和器官移植等所致的免疫功能紊乱的有效手段之一。

4-1BB配体在肿瘤细胞株上的表达及其与肿瘤细胞增殖的关系

目的检测4-1BBL在肿瘤细胞株上的表达及其功能。方法半定量RT-PCR检测几种肿瘤细胞株内4-1BBL mRNA表达;流式细胞术检测肿瘤细胞表面4-1BBL蛋白的表达;MTT法检测4-1BBLmAb对肿瘤细胞增殖的影响。结果4- 1BBL在Raji和THP-1细胞株表面表达率分别为26.8%和15.3%,而在T1301和Jurkat细胞株中,4-1BBL mRNA水平虽有一定表达,但蛋白水平却几乎不表达;4-1BBLmAb可以促进肿瘤细胞的增殖。结论4-1BBL在不同肿瘤细胞株上的表达有差异;4-1BBL在肿瘤细胞的增殖和长期存活中发挥重要作用。

可溶性PD-1和4-1BB配体在体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用

目的了解4-1BB配体(4-1BBL)治疗小鼠实验性肝癌时可能引起的负调控因素,以及可溶性PD-1(sPD 1)与4-1BBL协同治疗肿瘤的效应和机制。方法按照5×105／只的剂量将H22肝癌细胞接种于Balb／c小鼠右后腿肌肉内,建立小鼠实验性肝癌模型,随机分成5组,每组12只。空白对照组注射等渗盐水;pcDNA3．1组、p4-1BBL组和 pPD-1A组分别注射质粒pcDNA3．1、p4-1BBL和pPD-1A;p4-1BBL+pPD-1A组为联合治疗组,同时注射质粒p4- 1BBL和pPD-1A。观察小鼠肿瘤生长情况及存活率,检测两种基因在瘤周组织中的表达,对各组小鼠残存瘤细胞进行表型分析,检测肿瘤组织中的淋巴细胞。结果单独或联合转染4-1BBL基因和sPD-1基因均显示出抗肿瘤作用．尤以联合转染组小鼠肿瘤的生长抑制效果最为明显,该组有42％的小鼠肿瘤被完全抑制(其他各组完全抑制率为0);至实验第6周,联合转染组小鼠存活率达到100％,明显高于pcDNA3．1组(30％)、1)4-1BBL组(65％)、pPD-1A组(62％)。流式细胞术检测结果表明,p4-1BBL组残存瘤细胞上负调节性分子B7-H1和B7-DC的表达水平明显高于其他各组瘤细胞, 联合治疗组小鼠瘤周组织中CD8(?)T淋巴细胞数量明显增加。结论4-1BBL在促进抗肿瘤免疫应答的同时．也会引起负调节因素的上调,sPD-1可与4-1BBL产生协同治疗效应,增强机体抗肿瘤作用。

前列腺特异性膜抗原和4-1BB配体共表达基因疫苗诱导的抗肿瘤作用

目的探讨小鼠4-1BB配体（m4-1BBL）对截短的人前列腺特异性膜抗原（tPSMA）基因疫苗诱导的抗肿瘤作用。方法构建携带tPSMA和m4—1BBI。基因的真核表达载体pDC316-tPSMAIRES-m4—1BBL，以及编码tPSMA的对照载体pDC316-tPSMA和空载体pDC316。3种质粒分别于C57BL／6小鼠股四头肌内接种免疫，CCK-8试剂盒检测小鼠脾细胞体外特异性杀伤前列腺癌细胞株RM1-tPSMA的活性，观察小鼠体内肿瘤生长变化。结果pDC316tPSMA—IRES-m4—1BBI。疫苗诱导增强的靶细胞特异性杀伤率为42．62％，pDC316-tPSMA组为24．81％，pDC316组为10．81％，组间杀伤率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。pDC316疫苗免疫小鼠7d成瘤，瘤体积2657．4mm^3；pDC316-tPSMA组9d成瘤，瘤体积1334．5mm^3；pDC316-tPSMA—IRES-m4—1BBL组12d成瘤，瘤体积445．8mm^3；组间瘤体大小比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论共表达tPSMA和m4-1BBL的基因疫苗能显著增强小鼠抗前列腺肿瘤作用。

巨噬细胞炎性蛋白-1α联合4-1BB配体降低肝癌细胞体内致瘤性研究

目的观察巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP1α）联合4-1BB配体（4-1BBL）对肝癌细胞体内致瘤性的影响。方法以小鼠4-1BBL（m4—1BBL）重组逆转录病毒感染Hepa1-6小鼠MIP-1α（mMIP-1α），筛选并扩增抗性克隆，以流式细胞术检测m4—1BBL的表达，绘制并比较mMIP-1α和m4—1BBL同时或单独表达的Hepa1—6细胞的生长曲线。C57B／L小鼠随机分为7组，每组9只，各组分别接种Hepa1-6mMIP-1α＋m41BBL、Hepa1-6m4—1BBL、Hepa1-6mMIP-1α、Hepa1-6pBabepuro、Hepa1-6、Hepa1-6pLXSHD和PBS，观察比较各组肝癌细胞的致瘤性，比较各组小鼠的存活率。结果成功获得同时表达mMIP1α和m4—1BBL的小鼠肝癌细胞Hepa1—6mMIP—1α＋m4—1BBL，mMIP-1α和m4—1BBL同时或单独表达不影响Hepa16的生长曲线。观察5周，Hepa1-6mMIP-1α＋m4—1BBL接种的小鼠均未生长肿瘤，Hepa1-6mMIP-1α＋m4—1BBL的体内致瘤性低于Hepa1-6mMIP-1α和Hepa1—6m4—1BBL。接种Hepa1-6mMIP1α＋m41BBL的小鼠12周末存活率（9／9）高于接种Hepa1-6m41BBL小鼠（6／9）和Hepa1-6mMIP-1α小鼠（1／9）。结论趋化因子MIP-1α联合共刺激分子4-1BBL降低了肝癌细胞体内致瘤性，并使小鼠的生存期延长。

小鼠甲胎蛋白和4-1BB配体融合基因疫苗对树突状细胞生物学特性的影响

目的观察感染小鼠甲胎蛋白（mAFP）和4-1BB配体（m4—1BBL）融合基因对小鼠树突状细胞（DC）生物学特性的影响。方法构建含mAFP和m4—1BBL的融合基因腺病毒Ad-mAFP-内部核糖体起始位点（IRES）-m4-1BBL，感染H22肝癌细胞，Westernblot法检测mAFP和4—1BBL蛋白的表达；诱导培养DC，并将其分为实验组、载体对照组和阴性对照组，以上各组感染后观察DC形态学变化；流式细胞仪检测各组细胞表型；混合淋巴细胞反应（MLR）检测各组DC的刺激活性以及对T细胞分泌干扰素（IFN）-1的影响。结果成功构建融合基因重组腺病毒Ad—mAFP-IRES-m4-1BBL并表达于H22细胞；体外诱导培养获得典型的DC；流式细胞仪检测各组DC感染后的细胞表型，实验组DC细胞CD80[（60．7±8．7）％]、CD86[（67．0±4．6）％]表达率显著增高于其余两组（P〈0．05），刺激T细胞增殖能力（0．66±0．05）亦显著增强（P〈0．05），刺激T细胞分泌IFN-γ[（1280．7±68．2）ng／L]水平更高（P〈0．05）。结论成功构建含mAFP及4．1BBL融合基因腺病毒疫苗，其感染DC后刺激T细胞增殖和分泌IFN-γ的能力增强。

过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞共刺激分子4-1BB/4-1BB配体的表达

目的探讨免疫共刺激分子4-1BB/4-1BBL在过敏性紫癜(HSP)患儿外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其意义。方法 34例HSP患儿分为紫癜性肾炎(HSPN)组13例,过敏性紫癜无肾受累(NO-HSPN)组21例;20例健康儿童作为健康对照组。应用反转录-PCR(RT-PCR),并采用植物血凝素(PHA)和地塞米松(Dex)进行干预,检测各组儿童PBMC中4-1BB mRNA和4-1BBLmRNA的表达。结果 HSPN组及NO-HSPN组患儿4-1BB mRNA(0.921 3±0.229 9、0.855 8±0.235 7)、4-1BBL mRNA(0.440 2±0.118 4、0.407 4±0.076 2)的表达均明显高于健康对照组(0.539 3±0.145 7、0.296 9±0.071 2)(Pa<0.01)。加入PHA刺激后,3组4-1BB mRNA、4-1BBLmRNA表达均明显增高[(1.798 9±0.305 5)vs(0.921 3±0.229 9),(1.660 4±0.306 9)vs(0.855 8±0.235 7),(1.391 4±0.118 7)vs(0.539 3±0.145 7);(0.976 3±0.326 1)vs(0.440 2±0.118 4),(0.906 5±0.254 9)vs(0.407 4±0.076 2),(0.708 5±0.155 8)vs(0.296 9±0.071 2)(Pa<0.01)],且NO-HSPN及HSPN组增高较健康对照组升高更明显。加入Dex后,HSPN组及NO-HSPN组4-1BB mRNA、4-1BBL mRNA表达均明显减少[(0.534 8±0.127 8)vs(0.921 3±0.229 9),(0.502 0±0.105 3)vs(0.855 8±0.235 7);(0.298 9±0.078 0)vs(0.440 2±0.118 4),(0.274 4±0.059 2)vs(0.407 4±0.076 2)(Pa<0.01)],健康对照组的表达减少不明显。结论共刺激分子4-1BB、4-1BBL可能参与HSP的起病,提示二者可以作为监测HSP患儿病情的免疫学指标。

4-1BB及其配体4-1BBL在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 4-1BB及其配体4-1BBL在多种恶性肿瘤中有高表达,对肿瘤的发生、发展起着重要作用。方法方便选取胸外科手术切除的50例非小细胞肺癌标本为研究对象,手术时间及地点为2016—2017年贵州省人民医院,肺癌组织、埃癌旁组织中4-1BB、4-1BBL表达的检测采用采用免疫组织化学染色方法(SP法),其表达差异采用χ~2检验分析,并分析两种蛋白的表达与患者临床分期等相关信息间的相关性,并分析4-1BB、4-1BBL共同表达的相关性与NSCLC发生、发展的相关性。结果 (1)女性4-1BB/4-1BBL阳性率45.0%,男性4-1BB/4-1BBL阳性率76.6%,差异无统计学意义(P>0.05);(2)≥60岁患者4-1BB/4/1BBL阳性率71.4%,<60岁患者4-1BB/4/1BBL阳性率58.6%,差异无统计学意义(P>0.05);(3)有吸烟史患者阳性率69.6%,无吸烟史患者阳性率52.9%,差异无统计学意义(P>0.05);(4)肺癌组织,4-1BB阳性率62.0%,4-1BBL阳性率64.0%,癌旁组织中,4-1BB阳性率为36.0%,4-1BBL阳性率42.0%,差异有统计学意义(P<0.05);(5)T1期4-1BB阳性率35.0%,T2期4-1BB阳性率81.3%,T3期4-1BB阳性率85.7%,T1期、T2期、T3期差异有统计学意义(P<0.05),T2期、T3期差异无统计学意义(P>0.05);(6)无淋巴结转移患者4-1BB阳性率61.7%,有淋巴结转移患者4-1BB阳性率62.5%,差异无统计学意义(P>0.05);(7)4-1BB在I期阳性率47.6%,II期阳性率50.0%,IIIa期阳性率84.2%,Ⅲa期与I期差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ期与Ⅱ期相比、Ⅱ期与Ⅲ期相比差异无统计学意义(P>0.05);(8)4-1BBL在T1期阳性率55.0%,T2期阳性率68.7%,T3期阳性率71.4%,T1、T2、T3期差异无统计学意义(P>0.05);(9)无淋巴结转移4-1BBL阳性率61.7%,有淋巴结转移阳性率68.7%,差异无统计学意义(P>0.05);(10)4-1BBL在I期阳性率42.8%,II期阳性率80.0%,Ⅲa期阳性率78.9%,Ⅱ、Ⅲa明显高于I期,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ期与Ⅱ对比,Ⅱ期与Ⅲ期相比,差异无统计学意义(P>0.05);(11)4-1BB及4-1BBL在N分期中的表达差异无统计学意义。结论与癌旁组织相比,非小细胞肺癌组织明显具有更高的4-1BB及其配体4-1BBL表达水平,且二者相关于肺癌组织的临床分期和恶性程度,说明NSCLC发生、发展中,4-1BB及4-1BBL可能共同发挥了促进作用,肺癌诊断及评估患者预后时可采用这两项指标,研究表明,NSCLS发生及发展时,这两种蛋白的作用非常重要,未来研究中,可以这两种蛋白作为新的切入点,研究出更为有效的靶向治疗方案。

4-1BB及其配体在口腔癌免疫治疗中的作用

4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL)为肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家属的成员。研究发现,4-1BB和4-1BBL相互作用产生的共刺激信号在机体肿瘤免疫中起重要作用。本文通过对4-1BB/4-1BBL在共刺激作用的研究,探讨其在口腔癌免疫治疗中的潜在作用。

4-1BBL分子在脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义

目的:探讨共刺激分子4-1BBL(CD137L)在胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法:免疫组化方法检测4-1BBL在82例脑胶质瘤组织中的表达,并分析其与病理分级、患者年龄、性别及生存时间的关系。结果:正常3例脑组织标本未见4-1BBL表达。82例胶质瘤标本31例4-1BBL阳性,阳性表达率为37.8%。统计学提示组织标本中4-1BBL表达与病理级别无明显相关性,与年龄有关(P<0.05),4-1BBL阳性患者生存期更长(P<0.05)。结论:4-1BBL在部分胶质瘤组织中有表达,其表达对判断胶质瘤患者的预后有一定的参考价值。

4-1BBL修饰小鼠结肠癌疫苗体外诱导抗肿瘤免疫反应的研究

背景与目的:研究4-1BBL(4-1BB Ligand,即CD137配体)转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocytes,CTL)特异性杀伤活性及刺激淋巴细胞产生细胞因子的作用。材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKITneo/4-1BBL导入小鼠结肠癌colon26细胞,经G418筛选后获得4-1BBL高表达克隆,用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗,与经体外诱导的同系小鼠CTL共同培养,测定对CTL特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的影响。结果:转染4-1BBL的colon26细胞高表达4-1BBL蛋白,将该细胞经MMC处理后制成的瘤苗,与野生型colon26细胞相比,对CTL特异性杀伤亲本肿瘤细胞的作用明显增强(P<0.01),但CTL对非亲本肿瘤细胞的杀伤作用无明显影响(P>0.05);该瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的能力(P<0.01)。结论:4-1BBL转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗能有效诱导抗结肠癌免疫反应。

siRNA靶向抑制4-1BBL基因表达在HL-60细胞对淋巴细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察4-1BB配体(4-1BBL)-siRNA对HL-60细胞细胞因子分泌的影响;对比观察4-1BBL基因被干扰前后,HL-60细胞培养上清液对淋巴细胞增殖、凋亡诱导作用的影响;探讨肿瘤细胞的免疫逃逸机制。方法:采用化学合成法人工合成靶向人4-1BBL基因的siRNA,脂质体转染法转染HL-60细胞;半定量RT-PCR和流式细胞术检测干扰前后HL-60细胞4-1BBLmRNA和表面蛋白的表达水平; ELISA法检测4-1BBL干扰前后HL-60细胞培养上清液转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)分泌水平。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,收集4-1BBL干扰后的HL-60细胞培养上清液与体外分离的人淋巴细胞共培养,MTT法检测机体淋巴细胞增殖水平;流式细胞术检测淋巴细胞凋亡比率的变化。结果:靶向4-1BBLsiRNA转染HL-60后,4-1BBL-mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P <0. 01); ELISA结果显示,4-1BBL基因被干扰后,HL-60细胞培养上清液中TGF-β和VEGF分泌水平明显降低(P <0. 01和P <0. 05)。与干扰前比较,干扰后的HL-60细胞培养上清液对机体淋巴细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用均下降(P <0. 05)。结论:HL-60细胞高表达的4-1BBL信号具有反向调节作用,通过促进其分泌TGF-β、VEGF,使肿瘤细胞培养上清液对淋巴细胞活性的抑制作用增强并促进淋巴细胞凋亡,可能是肿瘤细胞逃避宿主免疫监视的机制之一。

4-1BBL通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人胃癌细胞的增殖和迁移

4-1BB和4-1BB配体(4-1BBL),又被称为CD137和CD137配体,分别属于肿瘤坏死因子(TNF)受体和配体家族的成员。4-1BBL与4-1BB相互作用可以激活T细胞免疫应答。因此,4-1BBL一直在抗肿瘤免疫应答中发挥经典的免疫共刺激分子作用。近期研究发现,4-1BBL在肿瘤细胞中另有其他的生物学功能,但4-1BBL在胃癌进展过程中的功能尚不明确。本文探讨了4-1BBL在人胃癌细胞中的生物学功能和分子作用机制。首先,通过检索TCGA和Kaplan Meier plotter数据库发现,4-1BBL在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.001),且4-1BBL的高表达与胃癌的不良预后正相关(P<0.05)。细胞生物学的结果显示,敲除4-1BBL明显抑制胃癌细胞的增殖(P<0.05)、侵袭和迁移(P<0.05),促进胃癌细胞的凋亡(P<0.05);另外,蛋白质免疫印迹结果表明,敲除4-1BBL可使β-联蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白质表达水平下降,抑制Wnt/β-catenin信号通路。相反,过表达4-1BBL则显著促进胃癌细胞增殖(P<0.05)、侵袭和迁移(P<0.05),减少胃癌细胞的凋亡(P<0.05);且过表达4-1BBL促进β-联蛋白(β-catenin)、c-Myc和细胞周期蛋白D1的蛋白质表达,激活Wnt/β-catenin信号通路。综上所述,4-1BBL可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进人胃癌细胞的增殖和迁移。

IL -15、IL-21和4-1BBL 增强NK-92细胞增殖和细胞毒性的实验研究

目的:探讨IL-15、IL-21和4-1BBL组成的不同培养体系,对体外扩增的NK-92细胞毒活性的影响。方法:以三质粒系统包被携带IL-15、IL-21和4-1BBL基因的慢病毒,用慢病毒感染的方式制备2组饲养层细胞;筛选后经MMC处理分5组体外扩增NK-92细胞(NK-92组:NK-92细胞;K562组:K562细胞+NK-92细胞;IL-15组:表达IL-15和4-1BBL的K562细胞+NK-92细胞;IL-21组:表达IL-21和4-1BBL的K562细胞+NK-92细胞;IL-15+IL-21组:表达IL-15和4-1BBL的K562细胞、表达IL-21和4-1BBL的K562细胞+NK-92细胞);通过CCK-8法,乳酸脱氢酶释放法检测体外扩增后NK-92细胞的细胞毒性;ELISA检测NK-92细胞上清中IFN-γ的水平,以评估NK-92细胞的抗肿瘤效应。结果:两组转染后的HEK293FT细胞以及慢病毒感染的K562细胞携带绿色荧光,两组饲养层细胞成功表达目的基因;各组饲养层细胞都能刺激NK-92细胞大量增殖;随着效靶比的逐渐增加,IL-15组扩增后的NK-92细胞毒性显著高于其余各组(P<0.05);效靶比为5∶1和10∶1时,IL-15组NK细胞IFN-γ的释放量显著高于其余各组(P<0.05)。结论:膜结合型IL-15、IL-21与4-1BBL联合都能引起NK-92细胞的大量增殖,且IL-15与4-1BBL联合运用扩增的NK-92细胞有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。

4-1BB及其配体的分子生物学研究进展

4-1BB是激活的T淋巴细咆表而抗原。属神经生长因了受体(NGF-R)/肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族,4-1BB通过与其相应配体(4-1BB-L)结合,不仅能调节T淋巴细胞的激活和生长,而且还能促进抗μ激活的B淋巴细胞的增殖。抗4-1BB抗体能诱导T淋巴细胞增殖,其抗肿瘤作用比抗CD28单抗和抗CTLA4单抗作用更强。以4-1BB为基础的免疫基因治疗有望成为临床治疗某些低免疫原性肿瘤的有效策略。

人NK细胞体外高效扩增的实验研究

目的:建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法:采用基因工程方法,在K562细胞上同时表达IL-15、IL-18、4-1BBL3种基因,构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL-15、IL-18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合,4-1BBL直接跨膜表达,使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次,以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,通过与IL-2的共刺激作用,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。结果:经过21d的刺激培养后,CD56+CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%。PBMC中的T细胞基本上没有得到扩增,扩增后的细胞中CD3+细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性,除了CD56+CD3-外,还对扩增的NK细胞上NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD94、CD158b、CD158a、NKB1、NKAT2等标记进行了验证。细胞毒实验表明,在效应细胞∶靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%。结论:建立的NK细胞体外扩增方法,达到了较高的扩增水平,且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料,能够实现NK细胞体外的大规模制备,这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫治疗奠定基础。

表达人CD137配体重组腺病毒的构建及其抗肿瘤免疫作用的研究

目的构建并制备表达人CD137L蛋白的5型重组腺病毒(Ad5-CD137L),并初步研究其在小鼠中的抗肿瘤免疫效果。方法将密码子优化CD137L蛋白的表达基因插入pDC316穿梭质粒,并与pBH-GloxΔE1,3Cre腺病毒骨架质粒,共同转染HEK293细胞,构建Ad5-CD137L种子。扩增并纯化后,对所得Ad5-CD137L重组腺病毒的插入目的基因与蛋白表达情况进行鉴定。检测Ad5-CD137L在C57BL/6小鼠体内的特异性细胞免疫和抗肿瘤免疫水平。结果成功地构建了Ad5-CD137L,PCR和测序结果表明插入目的基因与构建理论值相符。免疫荧光法鉴定Ad5-CD137L能在HEK293细胞中表达目的蛋白,经Western印迹法鉴定该目的蛋白的相对分子质量约为25 000,与理论值相符。与空腺病毒相比,Ad5-CD137L能显著诱导小鼠特异性IFN-γ(t=6.315,P=0.003),抗肿瘤免疫效果更显著(t21 d=8.275,t29 d=4.492;t39 d=5.101,P均<0.001)。结论成功构建了Ad5-CD137L,该重组病毒具有特异性细胞免疫原性和抗肿瘤免疫效果。