扇贝防御素基因改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究

目的应用改良5′cDNA末端快速扩增聚合酶链反应(RACE)筛选扇贝抗菌肽基因,寻找基于基因序列同源性的双壳类抗菌肽(AMP)的筛选方法。方法 TRIzol法提取扇贝血淋巴中总RNA。根据贻贝抗菌肽的保守序列设计基因特异性简并引物,进行改良5′RACE钓取可能防御素基因cDNA的5′端序列、AT克隆、DNA测序和同源性分析。结果采用改良5′RACE从扇贝血淋巴RNA中得到多个未知基因的cDNA 5′端序列,挑选600bp以下的基因片段进行AT克隆和DNA测序后得到3个插入片段序列,其长度分别为257、275和511bp。通过BLAST程序搜索GenBank核酸数据库,未发现与之高度同源的基因。结论从扇贝血淋巴中获得的3个5′端cDNA序列可能属于新的基因。应用改良5′RACE能钓取含防御素保守序列的新基因片段,由此表明此方案具有可行性。

利用Y-RACE法进行棉花胚珠cDNA末端快速扩增

在YADE(Y shapedadaptordependentextension)方法的基础上 ,设计了一种新的cDNA末端快速扩增方法 ,称为Y RACE法 .利用该方法只需一次cDNA合成就能进行多个基因的 3′和 5′末端的扩增 .分别利用Y RACE方法和RACE试剂盒 (TaKaRa)扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F0 2 7的末端序列 .序列比较表明 ,用Y RACE方法扩增的末端序列较试剂盒所得序列在最末端稍短 ,但同样能进行正确拼接并获得全长编码序列 .对Y RACE法的优缺点和可能的改进作了进一步讨论 .

反向嵌套PCR法高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA5′末端序列

采用反向嵌套PCR法 ,根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条 5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物 ,成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端。与锚定PCR法相比 ,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点 ,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。

一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA ,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物 ,利用一种新的cDNA末端快速扩增方法 (SMARTRACE)扩增该EST的 5′末端 ,并进行克隆测序 ,与mRNA差异显示获得ESTs拼接后 ,获得了三个新的全长cDNA。结果表明 ,SMARTRACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。

香蕉ACC合成酶cDNA5’末端的快速扩增

采用cDNA末端快速扩增(RapidamplificationofcDNAends,RACE)的方法对香蕉ACC合成酶的cDNA5’末端进行了扩增,获得677bp的产物,序列测定的结果表明,其中一个连续编码区编码149个氨基酸,其序列含有ACC合成酶的第一和第二保守区和一段长230bp的非翻译区。

一步PCR法快速扩增辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA3′末端序列

根据已获得的辽宁碱蓬 (SuaedaliaotungensisKitag)胆碱单加氧酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬胆碱单加氧酶cDNA 3′末端。与常规的3′_RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

丙型肝炎5'非编码区末端快速基因扩增方法的建立及应用

目的建立快速获得丙型肝炎(HCV)基因组5非编码区(5 UTR)真末端序列的分子生物学方法。方法逆转录后利用末端聚合酶(TDT)进行加尾反应,再利用套式聚合酶链反应(PCR)扩增出目的末端基因的cDNA片段,A-T克隆,用限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)与PCR鉴定重组子,全自动序列分析仪测定插入子序列。结果cD-NA末端快速扩增技术(RACE)获得5株HCV5 UTR克隆,包括3株全长克隆和2株缺失克隆。2株缺失克隆,一条在5末端缺失53个碱基,另一条缺失144个碱基。结论RACE技术快速、有效、实用,可有效获得丙型肝炎病毒基因组的5非编码区末端序列。

5′和3′末端快速扩增法克隆多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2

目的在多发性骨髓瘤患者中KIAA0058基因序列表达明显下调,从正常人骨髓单个核细胞中克隆该序列全长cDNA,以期更好地研究该序列结构,获得其功能信息。方法采用末端快速扩增法(RACE),进行多轮RT-PCR后,对PCR产物进行测序、拼接、证实,与NCBI核酸数据库进行比对。结果该序列全长cDNA长度为1913bp,登陆号为AY430097,与来源于人睾丸cDNA文库的序列DAZAP2同源性高达99%以上。该序列具有较短的5′非翻译区及长的3′非翻译区,开放阅读框序列从第84位碱基至590位碱基,具有poly(A)尾。结论利用RACE法,从骨髓单个核细胞中成功克隆了DAZAP2全长cDNA。

cDNA末端快速扩增法克隆高山离子芥原叶绿酸酯氧化还原酶基因及其表达特异性分析

用cDNA末端快速扩增技术从高山离子芥中克隆得到完整的原叶绿酸酯氧化还原酶(POR,EC:1.3.1.33)基因,命名为CbPORB,DNAMAN软件分析CbPORB和其他几种植物的POR基因,有很高的同源性,将其cDNA序列提交到NCBI数据库(序列接受号为FJ390503)。CbPORB基因全长1444bp,包含1个1209bp的开放阅读框(ORF),编码402个氨基酸的蛋白CbPORB(序列号为ACJ12925)。NCBI数据库在线软件计算高山离子芥CbPORB蛋白的等电点为9.43,推测其相对分子量为43.37kD。组织特异性表达分析显示:CbPORB在叶、茎中表达,根中不表达,具有器官特异性;干旱胁迫处理抑制CbPORB的转录水平;而表油菜素内酯(24-epibrassinolide;EBR)处理提高了CbPORB的转录水平。

cDNA末端快速扩增技术及其方法的改进

cDNA末端快速扩增(RACE)技术可以快速扩增mRNA3'和5'末端,从而获得全长的cDNA序列,为分离和研究新的基因提供了一个快速简便的方法。从RACE的原理出发,综述RACE技术的优缺点,阐述RACE技术的改良,并对其应用现状和发展前景进行了分析。

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.

一步PCR快速扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA3′末端序列(英文)

根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条基因特异性引物 ,与通用引物并用 ,一步PCR成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 3′末端。与常规的 3′RACE法相比 ,一步PCR法具有快速、简便、经济等优点 ,是一种非常快捷的扩增cDNA

cDNA末端快速扩增试剂盒研发进展

DNA扩增的方法有许多种,其中cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)因其操作简单、成功率相对较高、重复性好,被广泛应用于真核生物基因全长的克隆与分析。本文比较了市售的RACE试剂盒所采用的模板制备策略及改进的扩增方法。

RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以...

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。

基于cDNA末端快速扩增的刚地弓形虫核仁G蛋白-1的克隆

目的 克隆弓形虫核仁G蛋白- 1(NOG1)基因的全长cDNA序列。方法 根据NCBIGeneBank中登录的弓形虫NOG1基因的唯一EST序列设计引物,利用cDNA 5’-末端快速扩增法(5’-RACE)和cDNA 3’-末端快速扩增法(3’-RACE)分别对已知序列进行延伸,将扩增获得的3’-端和5’-端未知序列与位于中间位置的已知序列进行拼接,然后经Blast检验全长序列的正确性。结果 5’-RACE扩增获得3个不同长度的片断,最长片断全长12 87bp ,去除引物和夹杂的已知序列后,通过5’-RACE在5’端扩增获得未知序列为1196bp。3’-RACE扩增后得到一条特异性条带,位于大约1.7kb左右,测序全长为16 34bp ,去除引物和已知序列,经3’-RACE扩增获得的3’-端未知序列为12 0 4bp。Blast全长为316 7bp的3段拼接序列,发现其覆盖NOG1基因cDNA的完整ORF或者CDS序列(6 5 0bp 2 80 9bp)。推导翻译出的蛋白质一级结构包含719个氨基酸(aa) ,在所有已发现物种的NOG1中,弓形虫NOG1基因的cDNA和相应的aa序列都是最长的。该序列已登录NCBIGeneBank ,核酸序列登录号AY6 86 734,对应蛋白质的aa序列登录号为AAT94 2 90。结论 本研究首次克隆获得了弓形虫NOG1基因的全长cDNA序列,并对相应的aa序列进行了推导翻译和简单分析。

优化的套式核酸体外扩增方法用于甲型流感病毒快速诊断的研究

目的临床上对流感的有效控制与治疗在于实验室快速与准确的诊断,这对于指导用药和避免滥用抗生素具有重要意义。RT_PCR在流感病毒检测中特异性和灵敏度较强,nestedmultiplexRT_PCR法可以在此基础上提高灵敏度。实验的目的是应用分子生物学方法对流感病毒进行快速诊断。方法我们结合流感病毒M基因、NS基因、HA基因的结构和进化特性设计多元引物达到流感病毒的型和亚型准确与快速的鉴定。结果甲型流感病毒以M基因保守区域设计引物,PCR后电泳带为413bp;甲型流感病毒以HA基因分亚型,H1N1亚型PCR后电泳带为348bp,H3N2亚型PCR后电泳带为291bp,H5N1亚型PCR后电泳带为326bp。结论应用优化的套式核酸体外扩增方法进行流感病毒的型与亚型的诊断是比较快速的,且所需要的病毒量少(0.01～0.1TCID50),灵敏度较高。

T_4 DNA连接酶介导的5’RACE法克隆大鼠Nor 1全长cDNA

目的:克隆75AEST全长cDNA序列。方法:抽提在25mmol/L KCl条件下培养7d的大鼠小脑颗粒神经元的总RNA后,用DNA连接酶介导的5’RACE法克隆75A表达序列标签(EST)cDNA5’端未知序列,其产物亚克隆到pGEM-Teasy后进行序列测定以及同源性分性。结果:首轮5’RACE扩增出2.5kb序列后,75A EST鉴定为神经来源孤儿受体1(Nor1)基因的部分序列;再经过二次轮5’RACE,我们首次克隆Nor-1的全长cDNA序列。结论:T_4DNA连接酶介导的5’RACE是一种效率较高的克隆mRNA5’端未知序列的好方法,为进一步研究Nor1在小脑颗粒神经元存活或分化过程中的作用奠定基础。

应用cDNA末端快速扩增法扩增PNAS-2基因5’端未知序列的实验研究

硫化砷是中药雄黄的主要成分，其在白血病的治疗中取得了令人瞩目的疗效。我们应用基因表达谱芯片对硫化砷作用前后的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4的基因表达进行检测，结果发现凋亡相关基因PNAS-2（apoptosis-related protein，GeneBank ID：AF229832）在硫化砷作用后表达显著降低。有文献报道PNAS-2是一条与NB4细胞凋亡密切相关的基因，也有学者认为与细胞增殖有关。