巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6表达的影响

目的:观察巴马汀对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细白介素6(IL-6)表达的作用.方法:采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型,加入不同浓度的巴马汀,采用ELISA法检测IL-6的生成量;采用qRT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达.结果:巴马汀能明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成,以及IL-6mRNA的表达,并呈现出浓度依赖性.结论:巴马汀可通过抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-6的生成及IL-6mRNA的表达,从而发挥抗炎作用.

水合氯醛诱发RAW264.7巨噬细胞凋亡及其机制

目的:探讨水合氯醛处理对RAW264.7巨噬细胞凋亡的影响及其机制。方法:以不同浓度的水合氯醛对RAW264.7巨噬细胞处理不同时间,采用形态学观察、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂、Hochest33258染色和DNA ladder试剂检测RAW264.7巨噬细胞的凋亡情况,并检测Fas/FasL表达情况。结果:水合氯醛处理后RAW264.7巨噬细胞形态由梭形变圆直至脱落悬浮;Annexin V-FITC/PI双染检测显示水合氯醛处理可诱导RAW264.7巨噬细胞从早期向晚期凋亡,Hochest33258染色和DNA ladder检测均显示诱导凋亡;同时高表达Fas,但不表达FasL。结论:水合氯醛可通过Fas/FasL途径诱导RAW264.7巨噬细胞细胞凋亡。

小叶榕叶对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO和TNF-α的影响

目的采用体外炎症模型观察小叶榕叶水提物及其不同极性萃取部位对炎症介质一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法采用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞,建立体外炎症模型。采用噻唑蓝(MTT)法检测小叶榕叶水提物及其不同萃取部位对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用;Griess法检测培养液中NO含量;采用酶联免疫试验(ELISA)法检测培养液中TNF-α的含量。结果 LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,培养液中NO和TNF-α含量显著增加(P<0.01);小叶榕叶水提物及其不同萃取部位对NO和TNF-α的释放有不同程度的抑制作用,其中水提物高、中、低浓度组对NO的抑制率分别为17.0%,30.0%,33.0%;乙酸乙酯部位中、低浓度组对NO的抑制率分别为40.0%、27.0%;水相部分低浓度组对NO的抑制率为37.0%;水提物中浓度组和乙酸乙酯部位高浓度组对TNF-α的抑制率分别为58.0%,43.5%,与LPS组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论小叶榕叶可能通过抑制NO和TNF-α释放而发挥抗炎作用,其中乙酸乙酯部位、水相部分是小叶榕叶的主要抗炎活性成分。

巴马汀对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO分泌及iNOS表达的影响

目的:观察巴马汀对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞一氧化氮(NO)的分泌及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的作用。方法:采用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型,加入不同浓度的巴马汀,采用Griess法测定NO的分泌量;采用Western blot法检测iNOS蛋白的表达。结果:巴马汀能明显抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的分泌,以及iNOS蛋白的表达,并呈现出浓度依赖性。结论:巴马汀可通过抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的分泌及iNOS的表达,从而发挥抗炎作用。

lncRNA NEAT1在结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞中的表达及作用的初步探讨

目的检测RAW264. 7巨噬细胞在感染结核分枝杆菌后胞内lncRNA NEAT1表达变化;通过敲低巨噬细胞NEAT1表达,初步探讨其在巨噬细胞抗结核免疫应答中的作用。方法 H37Rv感染RAW264. 7巨噬细胞,分别在12、24、48 h后收集细胞和培养上清液,RT-qPCR检测细胞内NEAT1表达,ELISA检测上清中细胞因子白介素6 (IL-6)表达。利用RNAi技术沉默巨噬细胞NEAT1表达,检测H37Rv感染后细胞因子IL-6分泌及对H37Rv杀菌功能影响。结果与空白对照组比较,H37Rv感染巨噬细胞48 h后,细胞内NEAT1表达和上清中炎症因子IL-6水平均显著上升(P <0. 01)。沉默NEAT1的巨噬细胞感染H37Rv后,IL-6分泌显著下调(t=4. 45,P <0. 01),结核分枝杆菌清除能力显著下降(t=8. 98,P <0. 01)。结论 H37Rv感染RAW264. 7巨噬细胞可促进NEAT1表达上调,沉默NEAT1可减弱巨噬细胞对胞内H37Rv清除能力。

AcSDKP体外抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能研究

目的探讨N-乙酰-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对小鼠RAW264.7巨噬细胞促炎功能的影响。方法取小鼠RAW264.7巨噬细胞体外培养,分为对照组、脂多糖(LPS)组和LPS加不同浓度的AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L)处理组。采用荧光定量PCR法检测细胞肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞素(IL)-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA相对水平;使用Transwell小室检测RAW264.7细胞的趋化能力;采用Western blot法检测细胞iNOS、磷酸化的蛋白激酶复合体抑制物(p-IKK)、磷酸化的κ B抑制蛋白(p-Iκ B)和磷酸化的P65(p-P65)蛋白表达水平。结果 LPS处理组TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著高于对照组【分别高出(41±2.1)倍、(1073±80.8)倍和(1726±110.2)倍,P<0.01】;AcSDKP(10 nmol/L和100 nmol/L)处理组TNF-α水平显著低于LPS处理组【分别降低19.0%和39.3%,P<0.01】;AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100nmol/L)处理组IL-1β水平显著低于LPS处理组【分别降低22.08%、35.8%和38.2%,P<0.01】;AcSDKP(1 nmol/L、10 nmol/L和100 nmol/L)处理组IL-6水平显著低于LPS处理组【分别降低15.8%、35.7%和43.3%,P<0.01】;LPS处理组穿过小室的细胞数为(136±5.3)个/HP,显著高于对照组【(64±5.3)个/HP,P<0.01】,而AcSDKP处理组穿过小室的细胞数【分别为(105±4.8)、(85.3±5.0)和(73.7±5.6)个/HP】,显著低于LPS组【(136±5.3)个/HP,P<0.05】;LPS处理组iNOS mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组【分别为(21±2.5)倍和(5.9±0.4)倍,P<0.01】,而AcSDKP处理组iNOS mRNA显著低于LPS处理组【分别降低37.8%、23.3%和33.1%,P<0.05】;在10 nmol/L和100 nmol/L浓度AcSDKP处理组,两种蛋白水平显著低于LPS处理组【分别降低27.0%和40.2%,P<0.05】;LPS处理组p-IKK、p-Iκ B和p-P65表达量均显著高于对照组【分别为(25.9±4.8)倍、(9.5±0.6)倍和(2.1±0.2)倍,P<0.01】,而AcSDKP(10 nmol/L)处理组三者水平较LPS处理组显著下降【分别为42.5%、17.8%和29.7%,P<0.05】。结论 AcSDKP可抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,这一效应可能与阻断IKK/Iκ B/NF-κ B通路有关。

Ficolin 3的表达、纯化及其对RAW264.7巨噬细胞的活化作用

目的构建人ficolin-3基因的原核表达载体在大肠杆菌中表达后纯化,检测可溶性His-ficolin在诱导巨噬细胞系RAW264.7活化中的作用。方法从人外周血单个核细胞cDNA中扩增人ficolin-3基因的cDNA序列,将其插入pET22原核表达载体中,酶切鉴定并测序验证重组质粒pET22b-ficolin 3后,在大肠杆菌BL21中诱导表达并纯化His-ficolin 3。以His蛋白为对照,利用流式细胞术检测不同浓度可溶性His-ficolin 3对RAW264.7细胞吞噬鸡红细胞能力的影响,利用ELISA检测His-ficolin 3对RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α的影响。结果酶切鉴定获得预期目的片段,测序证实重组质粒pET22b-ficolin 3构建成功。SDS-PAGE提示相对分子质量(Mr)33 000处有可溶性目的蛋白His-ficolin 3表达,His柱纯化后产物纯度在90%以上。Western blot法检测证实纯化产物为His-ficolin 3。和His蛋白相比,His-ficolin 3对RAW264.7细胞的吞噬能力具有剂量依赖性,即His-ficolin3浓度越高,吞噬能力越强;此外,His-ficolin3能显著诱导RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α等炎性细胞因子。结论成功构建了pETb-Ficolin 3重组载体并获得了纯度为90%以上的His-ficolin 3。His-ficolin 3能够显著促进巨噬细胞RAW264.7的活化。

槐定碱与TLR4/MD-2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影响

目的:研究槐定碱及TLR4/MD-2阻断剂对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TLR4-NF-κB-TNF-α通路的影响,探讨其抗内毒素的药理机制。方法:培养RAW264.7巨噬细胞,分为5组:空白对照组,LPS模型组,槐定碱+LPS组,TLR4/MD-2阻断剂+LPS组,TLR4/MD-2阻断剂+槐定碱+LPS组,各组分别于处理完毕后120 min时收集细胞及细胞培养液。West-ern blot检测TLR4蛋白表达,免疫细胞化学检测NF-κB蛋白的分布与表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测NF-κB,TNF-αmRNA表达,放射免疫分析法检测细胞培养液中TNF-α含量。结果:与LPS模型组比较,槐定碱+LPS组TLR4蛋白,NF-κBmRNA与NF-κB入核率,TNF-αmRNA及培养液中TNF-α含量均显著降低(P<0.01);TLR4/MD-2阻断剂+LPS组与TLR4/MD-2阻断剂+槐定碱+LPS组NF-κB mRNA及NF-κB入核率,TNF-αmRNA及培养液中TNF-α含量均低于LPS模型组(P<0.01),接近空白对照组,但2组之间上述各值的差异均无统计学意义。结论:TLR4/MD-2可能是槐定碱作用的靶位之一,槐定碱抑制TLR4-NF-κB-TNF-α通路活化可能是其抗内毒素机制之一。

结核分枝杆菌优势蛋白ppe37的表达纯化以及对巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响

目的研究在结核分枝杆菌感染过程中,ppe37蛋白引起的巨噬细胞免疫应答反应。方法利用本实验室已构建好的ppe37原核表达载体,将其转化到大肠杆菌E.coli BL21中,用IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE与Western blot鉴定后,利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行纯化并复性。利用SDS-PAGE和AlpHaImager 2200软件对纯化蛋白进行鉴定与分析。分别用浓度为100ng/mL、500ng/mL、5 000ng/mL的重组ppe37蛋白刺激RAW264.7巨噬细胞,24h、48h、72h后,用Real-time PCR检测RAW264.7巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达量的变化。结果 SDSPAGE鉴定显示,重组ppe37蛋白获得了大量表达,其相对分子质量约为50kDa。经Western Blot验证,重组ppe37蛋白可与抗His单抗发生特异性反应,经AlpHaImager 2200软件薄层扫描分析,重组蛋白的纯度为96.2%,并成功的进行了蛋白复性。浓度分别为100ng/mL,500ng/mL,5 000ng/mL的重组ppe37蛋白刺激巨噬细胞,24h后Real-Time PCR检测结果显示与空白对照组相比NF-κB、TNF-αmRNA的表达没有影响(P>0.05),而IL-6mRNA的表达上调(P<0.05);48h、72h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达显著上调(P<0.05)。结论成功地制备并纯化了重组ppe37蛋白,重组ppe37蛋白能够活化巨噬细胞,激活细胞免疫反应,并促使巨噬细胞发生炎性反应。

姜黄素对小鼠巨噬细胞RAW264．7分型的影响及机制研究

目的动脉粥样硬化是一种炎症免疫性疾病，巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起非常重要的作用。巨噬细胞M1／M2亚型平衡的动态变化影响着炎症的转归。本实验通过研究姜黄素对巨噬细胞分型的影响及可能机制，探讨姜黄素抑制动脉粥样硬化发生发展的分子基础。方法培养的小鼠RAW264．7巨噬细胞（M0），用常规方法（100μg／LLPS＋2．5μg／LIFN-1干预12h）诱导成M1型。姜黄素干预细胞浓度为0．6．25、12．5、25μmoL／L。

绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

目的探讨绿豆肽对RAW264. 7巨噬细胞的免疫调节作用。方法在体外培养的RAW264. 7巨噬细胞中,分别加入10、100、200和400μg/mL的绿豆肽,检测RAW264. 7巨噬细胞的增殖能力、吞噬能力、SOD酶活力、NO含量和细胞因子分泌量,同时检测绿豆肽对经脂多糖(lipo-polysaccharide,LPS)诱导的RAW264. 7巨噬细胞中细胞因子分泌和LC3、p62蛋白表达水平的影响。结果与空白对照组比较,不同浓度绿豆肽组RAW264. 7巨噬细胞的增殖率及吞噬率显著提高(P <0. 05),400和200μg/mL组的SOD酶活力、NO含量及分泌TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显著升高(P <0. 05)。各浓度绿豆肽均可显著抑制LPS诱导RAW264. 7巨噬细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量(P <0. 05),浓度为400μg/mL时,上述细胞因子的分泌量与空白对照组差异无统计学意义(P> 0. 05)。不同浓度绿豆肽均可降低LPS诱导RAW264. 7巨噬细胞胞内LC3的含量,上调p62蛋白的表达量。结论绿豆肽可激活巨噬细胞、增加自身代谢酶活力、释放细胞因子,通过抗炎作用及抑制细胞自噬,从而提高宿主细胞的免疫功能。

金雀异黄素对脂多糖诱导的巨噬细胞MAPK和TLR信号转导通路的影响

目的研究金雀异黄素对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路和Toll样受体(TLR)通路的影响。方法用100 ng/mL脂多糖和金雀异黄素分别处理RAW264.7巨噬细胞不同时间后,采用Western blot法检测对MAPK信号通路蛋白磷酸化的影响;采用RT2 ProfilerTMPCR芯片检测金雀异黄素对LPS诱导的TLR信号转导通路基因表达的影响。结果 LPS能够显著诱导蛋白p38和p42/44磷酸化,激活MAPK信号通路,金雀异黄素能够加强其作用,同时,LPS能够显著诱导TLR信号转导通路的细胞因子基因表达,包括IFN-β、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、集落刺激因子2(CSF-2)、CSF-3、趋化因子CCL2和CXCL10、环氧合酶2(COX-2)、NF-κB1和IκB-α等,金雀异黄素能够显著降低这些上调基因的表达。结论金雀异黄素能够显著增强LPS激活的MAPK信号通路并抑制TLR信号通路的激活。

脾酪氨酸激酶抑制剂对脂多糖诱导巨噬细胞炎症反应的影响及机制

目的研究脾酪氨酸激酶（Syk）在LtX3诱导的Toll样受体4（TLR4）信号转导通路的作用。方法用100ng／mL脂多糖和不同浓度Syk抑制剂分别处理RAW264．7巨噬细胞后，采用Alarmar blue方法检测细胞增殖；采用Griess试剂检测细胞培养液中NO的含量；Westernblot法检测诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的蛋白表达；ELISA检测巨噬细胞中TNF-α和IL-6含量，RAW—Blue巨噬细胞检测核因子KB（NF—KB）和激活子蛋白-1（AP-1）的活化。结果Syk抑制剂作用于RAW264．7巨噬细胞24h，（0．5～14．0）μmol／L的Syk抑制剂对细胞增殖无明显影响，但当剂量超过1．5μmol／L时，能显著抑制LPS刺激的RAW264．7巨噬细胞NO的产生和iNOS的蛋白表达，抑制TNF-α和IL-6的产生（P〈0．01）以及NF—KB和AP-1的激活。结论Syk抑制剂降低LPS诱导的巨噬细胞分泌NO和iNOS的蛋白表达及TNF-α和IL-6的释放，通过下调Syk下游TLR4受体信号传导通路的蛋白，进而显著降低转录因子NF-KB和AP-1的激活有关。

S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺对巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的影响

目的观察S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺(SNAP)对RAW 264.7诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨NO在动脉粥样硬化(炎症)过程中的作用。方法以RAW 264.7巨噬细胞为研究对象,分为空白对照组、SNAP组,采用不同浓度(30、100、300、400、500μmol/L)的SNAP对巨噬细胞进行干预24 h,应用RT-PCR法检测RAW 264.7巨噬细胞iNOS mRNA的表达,采用Western blotting技术检测iNOS蛋白的表达。结果与空白对照组比较,不同浓度SNAP(30、100、300、400、500μmol/L)组iNOS mRNA的表达比空白对照组均明显降低(P﹤0.05),不同浓度SNAP(30、100、300μmol/L)组iNOS蛋白表达明显低于空白对照组(P﹤0.05)。结论 NO可以抑制巨噬细胞自身iNOS mRNA基因转录,降低iNOS的合成而发挥负反馈作用。

解毒祛瘀滋阴方含药血清对小鼠单核巨噬细胞IRAK1信号通路表达的影响

目的通过研究解毒祛瘀滋阴方含药血清对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后小鼠单核巨噬细胞白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)信号通路的影响,探讨解毒祛瘀滋阴方对IRAK1、NF-κB炎症信号通路的影响,为其抗炎临床用药提供良好的理论支持。方法该研究拟采用体外培养小鼠单核巨噬细胞,随机分为空白组、LPS刺激组、中药血清组、空白血清组、LPS加中药血清组、LPS加空白血清组、IRAK1抑制剂组、抑制剂加LPS组、抑制剂加中药血清组及抑制剂加空白血清组。干预24 h后,采用CCK8法检测解毒祛瘀滋阴方对细胞的活力,采用ELISA法检测细胞上清中肿瘤坏死因-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量;采用免疫荧光化学染色法检测解毒祛瘀滋阴方对小鼠单核巨噬细胞中IRAK1表达的影响;采用RT-PCR法检测IRAK1、核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、TNF-α及白介素6 (interleukin-6,IL-6) mRNA的表达;采用Western-blot法检测IRAK1、p-IRAK1、NF-κB蛋白水平表达;采用LC-MS检测中药组血清中的有效成分。结果中药含药血清组以2. 5%为最佳给药浓度,解毒祛瘀滋阴方能下调TNF-α和IL-6的表达及抑制IRAK1表达和NF-κB的活化(P <0. 05),中药组含药血清中检测到芍药苷和阿魏酸。结论解毒祛瘀滋阴方能抑制LPS刺激后小鼠单核巨噬细胞IRAK1、NF-κB的表达,为其抗炎临床用药提供良好的理论支持。

基于“IL-34”-Rho/Rock信号通路探讨生地黄水煎总提物对动脉粥样硬化的作用分析

目的观察生地黄水煎总提物对动脉粥样硬化(AS) Apo E-/-小鼠脂质斑块的改善作用以及对"IL-34"-Rho/Rock通路的影响。方法①动物实验:将40只Apo E-/-小鼠分成空白对照组(CTL组)、模型对照组(Model组)、5μg·g^(-1)生地黄干预组(Reh-L组)和10μg·g^(-1)生地黄干预组(Reh-H组)。空白对照组小鼠给予普通饲料,其余组小鼠腹腔注射人血清低密度脂蛋白(LDL) 2周,并喂以高脂饲料。连续灌胃4周,检测小鼠血脂指标,并计算AS指数(AI)。②细胞实验:将RAW264. 7细胞分为空白对照组(con组)、ox-LDL组、IL-34组和Reh组;油红O染色观察泡沫细胞形成,检测细胞内胆固醇酯含量和胆固醇流出率。免疫荧光染色法、qRT-PCR法和Western blot法检测Rho A和Rock1表达量。结果①动物实验:Reh-H组小鼠外周血TC、TG、LDL-C、内皮素-1(ET-1)、白介素-34(IL-34)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)水平、AI值以及AS斑块面积比低于Model组和Reh-L组,而HDL-C水平高于Model组和Reh-L组(P <0. 05)。经qRT-PCR法和Western blot法检测,Reh-H组小鼠主动脉组织Rho A和Rock1表达量较Model组和Reh-L组降低(P <0. 05)。②细胞实验:经oxLDL和IL-34共诱导,RAW264. 7细胞内胆固醇酯含量、胆固醇流出率以及Rho A和Rock1蛋白表达量较con组和ox-LDL组细胞增加(P <0. 05)。而加入Reh干预后泡沫细胞数量、胆固醇酯含量、胆固醇流出率以及RAW264. 7细胞Rho A和Rock1蛋白表达量较IL-34组细胞明显减少(P <0. 05)。结论生地黄可通过抑制"IL-34"-Rho/Rock信号通路抑制巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞,从而有效地预防AS的形成和进展。