过表达microRNA-7对人肺癌95D细胞凋亡的影响

目的探讨过表达micro RNA-7对人肺癌95D细胞体内外凋亡的作用。方法将mi R-7真核表达载体(命名为p-mi R-7)体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用TUNEL法观察95D细胞凋亡的变化;免疫荧光技术检测各组细胞磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达;建立人肺癌裸鼠模型,肿瘤局部注射p-mi R-7后利用TUNEL法检测肿瘤局部细胞凋亡变化,同时,免疫组织化学法检测凋亡相关的磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白的表达变化。结果体外转染p-mi R-7后可导致人肺癌细胞的凋亡(P<0.05)。同时,细胞中磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平显著增加(P<0.05);肿瘤局部注射p-mi R-7后,肿瘤局部mi R-7表达水平及细胞凋亡也明显增强(P<0.05),磷酸化Caspase3和Caspase9蛋白水平也显著增加。结论过表达mi R-7可以导致肿瘤细胞凋亡,这与凋亡相关蛋白Caspase3和Caspase9磷酸化水平增加有关。

海参皂苷Des-echinoside A通过NF-κB信号通路抑制人肺巨细胞癌95D细胞转移

采用高速逆流色谱法从革皮氏海参中分离纯化得到皂苷单体Des-echinoside A,研究了Des-echinoside A对高转移人肺巨细胞癌95D细胞增殖和转移的影响及其分子机制。结果显示:Des-echinoside A能显著降低95D细胞增殖(P<0.01)、迁移(P<0.01)、侵袭(P<0.01)以及粘附能力(P<0.01);还能显著抑制鸡胚尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)上的血管新生。Des-echinoside A能显著降低u PA、MMP-2/-9、VEGF和NF-κB mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),显著上调TIMP-1/-2 mRNA的表达(P<0.01),提示Desechinoside A可能通过调控NF-κB信号通路抑制95D细胞转移。

miR-155对人肺癌95D细胞生物学行为的影响

目的:构建携microRNA-155(miR-155)的真核表达载体并观察其转染高转移性人巨细胞肺癌95D细胞后细胞的生物学行为变化。方法:以95D细胞基因组RNA为模板,经PCR法扩增miR-155的前体序列,由BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将其亚克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),并进行双酶切及测序鉴定;将构建成功的pcDNA3.1(-)-pri-miR-155载体(命名为p-miR-155)体外瞬时转染人肺癌95D细胞,利用Real-time PCR探针法检测miR-155成熟体的表达水平,并利用CCK-8法、克隆形成实验和划痕法检测95D细胞的增殖、克隆形成以及体外迁移能力。结果:成功构建携miR-155的真核表达载体;与空白(Mock)和对照组(p-Ctrl)相比,转染后的95D细胞过表达miR-155[(2.04±0.62)vs(0.76±0.62)、(1.00±0.45),均P<0.01]、p-miR-155载体转染组95D细胞的增殖抑制明显增加[(46.70±6.89)%vs(3.70±1.40)%、(1.11±0.75)%,P<0.01]、克隆形成能力(在100和1 000个细胞/孔接种条件下)明显下降[(12±3)vs(34±3)、(35±3)个,P<0.01;(78±4)vs(159±4)、(165±4)个,P<0.01)],此外,细胞的迁移细胞数也明显减少[(110±5)vs(295±5)、(325±5)个,P<0.01]。结论:通过miR-155真核表达载体转染产生的过表达miR-155可显著抑制人肺癌95D细胞的增殖和迁移能力。

海参皂苷EchinosideA通过uPA信号通路抑制高转移95D细胞转移

研究海参皂苷Echinoside A对高转移人肺巨细胞癌95D细胞增殖和转移的影响及其分子机制。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法检测Echinoside A对95D细胞生长的影响;采用Transwell实验、黏附实验评价Echinoside A抗95D细胞转移活性;采用鸡胚尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)实验评价Echinoside A抗血管新生活性;采用逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测95D细胞转移相关基因和蛋白的表达。结果表明,Echinoside A能显著降低95D细胞增殖(P<0.01)、侵袭(P<0.01)、迁移(P<0.01)以及黏附能力(P<0.01);还能显著抑制CAM上的血管新生。Echinoside A能显著降低尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9 mRNA的表达,显著上调金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP)-1、TIMP-2 m RNA的表达,同时在基因和蛋白水平显著下调血管内皮生长因子的表达。提示Echinoside A可通过调控uPA信号通路,保护细胞外基质结构,从而抑制95D细胞转移。

微小RNA-7对人肺癌95D细胞体外增殖的作用

目的:探讨微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)对人肺癌95D细胞体外增殖的作用。方法:采用体外转染法将miR-7瞬时转染95D细胞后,应用Real-time PCR特异探针法检测95D细胞中miR-7的表达情况,应用MTT法检测95D细胞的生长情况,FCM法分析细胞周期变化,并用Western印迹法检测95D细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达的变化。结果:与对照组相比,miR-7转染组95D细胞的miR-7表达水平显著增加(P<0.05),细胞生长明显受抑(P<0.05),且主要阻滞在G1期(P<0.05),而EGFR表达显著下调。结论:miR-7可以抑制人肺癌95D细胞的体外增殖,可能作为后续肺癌生物治疗的新靶点。

miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响

目的构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响。方法克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3.1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3.1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响。结果重组质粒pcDNA3.1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍。MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72 h抑制率最高,达38.63%。结论成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3.1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应。为进一步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础。

Ad-GFP-nm23-H1体内外抑制人高转移肺巨细胞癌株95D生长和转移作用的研究

目的观察Ad-GFP-nm23-Hl抑制人高转移肺巨细胞癌株95D细胞生长和转移的作用,为后期nm23-Hl基因和腺病毒载体用于95D及其他肿瘤的基因治疗提供一定的理论和方法。方法应用MTT法及Transwell小室法分别检测95D细胞经Ad-GFP-nm23-Hl作用后的细胞体外增殖活性、黏附能力以及侵袭力的变化。同时应用人高转移肺巨细胞癌株95D裸鼠移植瘤模型,研究Ad-GFP-nm23-Hl对此移植瘤生长的抑制作用。结果108PFU/ml、109PFU/ml、1010PFU/ml处理组,可以明显抑制95D细胞的增殖、黏附和侵袭能力,其抑制作用呈剂量-效应关系。109PFU/ml的Ad-GFP-nm23-Hl对移植瘤的抑瘤率为38.23%,较对照组差异显著。结论Ad-GFP-nm23-Hl对人高转移肺巨细胞癌株95D细胞的生长和转移以及95D实体瘤具有抑制作用。

过表达microRNA-7通过下调CGG结合蛋白1的表达抑制人肺癌细胞生长

目的探讨过表达microRNA-7(miR-7)对人肺癌细胞体内外生长的作用和可能机制。方法利用真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(p-miR-7),体外瞬时转染95D人肺癌细胞,MTT法和克隆形成实验检测95D细胞的增殖变化;免疫荧光技术检测95D细胞Ki-67和CGG结合蛋白(CGGBP1)的表达;建立人肺癌裸鼠肿瘤模型,肿瘤局部注射p-miR-7真核表达载体,测量肿瘤大小并观察小鼠生存时间;实时PCR检测肿瘤组织中miR-7表达水平;免疫组织化学技术检测组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达。结果过表达miR-7可明显抑制肺癌细胞的体外增殖(P<0.05),Ki-67和CGGBP1的表达显著减少(P<0.05);体内实验结果显示,局部注射p-miR-7组中miR-7表达水平明显增加,同时荷瘤裸鼠的肿瘤生长缓慢,生存时间明显延长(P<0.05)。肿瘤组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达量均显著减少(P<0.05)。结论过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体内外生长,可能与其下调肿瘤生长相关蛋白CGGBP1的表达有关。

过表达miR-126对人肺癌细胞体外生长的抑制作用和初步机制研究

目的:探讨过表达miR-126对人肺癌95D细胞体外生长的影响。方法:利用PCR技术成功构建pc DNA3.1(-)-pri-miR-126载体(命名为p-miR-126),将p-miR-126重组质粒体外瞬时转染人肺癌95D细胞,Taq Man探针法检测miR-126的相对表达水平,CCK-8(cell counting kit-8)法和划痕法分别检测95D细胞的增殖、迁移能力。Western Blot检测95D细胞中蛋白AKT和磷酸化AKT(phosphorylation AKT,p-AKT)的表达情况。结果:成功构建miR-126真核表达载体,且该载体可上调miR-126表达(P<0.05),抑制95D细胞的生长和迁移能力(P<0.05)。Western Blot结果表明细胞中磷酸化AKT水平显著降低(P<0.05)。结论:通过上调miR-126的表达水平可有效抑制95D细胞的体外生长,其作用机制有可能与AKT信号通路的变化有关,但其具体机制仍需后续深入研究。

康莱特注射液与泰素帝合用对肺癌细胞的增敏作用研究

目的研究康莱特注射液与泰素帝合用对人肺腺癌细胞95D的抑制作用,并寻找康莱特在联合化疗时的最佳给药时机。方法以体外人肺腺癌95D细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑盐M(TT)比色法研究康莱特对泰素帝的化疗增敏作用。结果康莱特单药对人肺腺癌95D细胞的生长有抑制作用,联合泰素帝的抑制率高于单药组;康莱特先于泰素帝18h加入对95D的抑制作用最强。结论康莱特对体外肺癌细胞有抗肿瘤和化疗增敏作用;康莱特先于泰素帝18h加入对95D的抑制作用最强。为康莱特的临床应用提供合理用药的方法。

重组抑瘤素M抑制肿瘤细胞增殖转移的研究

目的考察重组表达的抑瘤素M(oncostatinM,OSM)对肿瘤细胞增殖转移的抑制能力。方法在大肠杆菌中重组表达了人抑瘤素M,并通过MTT检测实验、软琼脂克隆形成抑制实验、粘附抑制实验、细胞移动能分析实验和浸润杯实验来考察重组hOSM对高转移人肺腺癌细胞95-D增殖和侵袭转移过程的抑制能力。结果重组hOSM在上述体外模型中能以较低浓度有效抑制95-D肿瘤细胞的增殖和转移。结论原核表达的人抑瘤素M在对肺癌的临床治疗中具有潜在的应用价值。

微小RNA-125b对肺癌细胞95D生物学功能的影响

[目的]探讨微小RNA(miR)-125b对肺癌细胞95D生物学功能的影响。[方法]以95D细胞为实验对象,分别转染miR-125b模拟物和模拟物阴性对照,未经特殊处理为空白组。应用MTT法、流式细胞仪和Transwell小室法分别检测miR-125b表达改变对95D细胞增殖、凋亡、周期及侵袭的影响。[结果]95D细胞转染48 h后,转染组miR-125b的水平提高,表达量为阴性对照组的22.32倍。与阴性对照组相比,miR125b模拟物转染组细胞凋亡率明显降低[(13.77±-0.52)%,(9.90±1.33)%,P<0.05],细胞增殖、周期、侵袭无显著改变(P>0.05)。[结论]miR-125b基因过表达能够抑制肺癌95D细胞凋亡。

肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白的筛选及验证

目的筛选肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis related protein 1,LCMR1)的相互作用蛋白并进行验证。方法以人肺癌95D细胞RNA作为模板,构建95D细胞c DNA文库。将LCMR1质粒及人肺癌95D细胞c DNA文库共转化酵母菌AH109,初步筛选LCMR1相互作用蛋白。应用融合蛋白沉降技术和免疫共沉淀技术对酵母双杂交结果进行验证,确定蛋白质相互作用。结果成功构建了人肺癌95D细胞的c DNA文库。应用酵母双杂交技术筛选出6种LCMR1相互作用蛋白,选取其中DEK原癌基因进行验证。使用融合蛋白沉降技术及免疫共沉淀技术证实,LCMR1蛋白与DEK蛋白在体外及细胞内均可以特异结合,特异结合发生在DEK蛋白N端功能区。结论 LCMR1与DEK为相互作用蛋白,DEK蛋白N端功能区与细胞凋亡密切相关,为LCMR1基因功能研究提供线索和相应分子基础。

自身启动子调控miR-7真核表达载体的构建及其意义

目的构建带有miR-7自身启动子的miR-7重组真核表达载体,研究其对人肺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法预测miR-7启动子序列,设计含有该序列和miR-7前体序列目的片段的引物,PCR扩增后亚克隆入p GL3.0-Basic载体以构建miR-7自身启动子调控的真核表达载体p GL3.0-Basic-miR-7-promoter(命名为p-miR-7-pro);将所构建载体转染人肺癌95D细胞,Real-time PCR探针法检测95D细胞中miR-7的表达水平;MTT和克隆形成实验分别检测95D细胞的增殖和克隆形成能力;划痕法观察95D细胞体外迁移能力的变化;FACS检测95D细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果证明成功构建p-miR-7-pro真核表达载体,转染95D细胞后可有效表达miR-7;与对照组相比,p-miR-7-pro转染组95D细胞的体外增殖能力受到明显的抑制(0.60±0.03 vs 0.19±0.05,P<0.05);同时其迁移能力也显著降低(473±7 vs 99±2,P<0.05);而细胞凋亡则显著增加(9.233±0.586%vs 12.967±0.643%,P<0.05)。结论成功构建由自身启动子调控的miR-7真核表达载体,为后续研究miR-7在肺癌基因治疗中的作用提供重要实验基础。

pG-miR-7-Sponge转基因小鼠载体的构建及鉴定

目的构建pG-miR-7-Sponge转基因小鼠的真核载体并检测其表达活性,为转基因小鼠的建立提供前期实验基础。方法利用miRNA sponge(海绵体)技术原理,合成miR-7-Sponge序列,酶切连接入真核表达载体eGFP-C2并转化Stbl3感受态细胞,克隆PCR、酶切和测序鉴定重组载体eGFP-C2-miR-7-Sponge(简称pG-miR-7-Sp);将重组载体pG-miR-7-Sp体外瞬时转染人肺癌95D细胞,荧光显微镜下观察细胞的GFP表达情况;Real-Time PCR检测细胞中miRNA-7的表达;MTT法检测细胞的增殖变化。结果经克隆PCR、酶切鉴定及测序分析,成功构建了真核表达载体pGmiR-7-Sp;pG-miR-7-Sp瞬时转染95D细胞48 h后,与对照组细胞相比,miR-7表达水平明显降低(P<0.05);同时细胞的生长明显加快(P<0.05)。结论成功构建pG-miR-7-Sp真核表达载体。

微小RNA-7慢病毒过表达载体的构建及其作用

目的构建miR-7慢病毒过表达载体,并对人肺癌细胞进行感染,观察其影响效果。方法设计引物,PCR法扩增miR-7初级序列;纯化、经BamH I和EcoR I双酶切后将其亚克隆入pLVX-shRNA慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定;将构建成功的pLVX-shRNA-miR-7（命名为p LV-miR-7）载体体外转染293T细胞进行包装,在48 h收获上清,用Real-time PCR法测定该慢病毒滴度;将制备好的病毒上清体外感染人肺癌95 D细胞后,用Real-time PCR检测各组中miR-7成熟体表达水平;CCK-8法检测95 D细胞生长变化。结果菌液PCR和酶切结果显示miR-7目的片段418 bp成功构入载体pLVX-shRNA;同时结合测序结果证明构建miR-7慢病毒过表达载体成功;慢病毒上清滴度为1.53×10^7copies/mL;该病毒感染人肺癌95 D细胞后可有效表达miR-7成熟体,并显著抑制细胞的体外生长（P〈0.05）。结论成功构建miR-7慢病毒过表达载体,为进一步探究miR-7在肺癌发病机制中的作用提供了重要实验基础。

水红花子总提取物及各化学部位体外抗肿瘤活性研究

目的:研究水红花子乙醇总提取物(SH1)及各化学部位对人肺高转移细胞株95D增殖的抑制作用,筛选水红花子抗肿瘤主要活性部位。方法:以人肺高转移细胞株95D作为实验用细胞株,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比象(MTT)法对水红花子总提取物(SH1)、石油醚部位(SH2)、乙酸乙酯部位(SH3)、丙酮部位(SH4)和甲醇部位(SH5)进行抗肿瘤活性研究。结果:水红花子各化学部位对人肺高转移细胞株95D有明显的抑制作用,水红花子乙酸乙酯部位和丙酮部位的半数抑制浓度分别为199.1 mg·L-1、261.2 mg·L-1。结论:水红花子乙酸乙酯部位和丙酮部位对人肺高转移细胞株95D细胞增殖的抑制作用较强,为水红花子主要活性部位。

miR-610通过调控缝隙连接α3蛋白的表达抑制人肺癌细胞的增殖和侵袭

目的探讨miR-610对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制。方法应用real-imePCR法检测miR-610在高低不同转移潜能肺癌细胞株95D和95C中的表达。分别将miR-610模拟物和抑制物转染入95D和95C细胞，应用细胞计数盒8（CCK-8）法和5-溴-2’-脱氧尿苷（BrdU）掺入实验检测miR-610对肺癌细胞增殖的影响；应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测miR-610对肺癌细胞侵袭的影响。以生物信息学软件预测miR-610的潜在靶基因，采用双荧光素酶报告基因系统和Westernblot法验证miR-610对缝隙连接α3蛋白（GJA3）表达的调控作用。结果miR-610在低转移肺癌细胞95C中的表达水平是其在高转移肺癌细胞95D中的表达水平的（8．75±0．21）倍（P〈0．01）。空白对照组和转染miR-610抑制物组95C细胞的增殖细胞数分别为（37．41±2．39）％和（59．63±4．57）％，空白对照组和转染miR-610模拟物组95D细胞的增殖细胞数分别为（68．75±4．28）％和（46．13±3．27）％，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。划痕24h和48h后，转染miR．610抑制物组95C细胞划痕的宽度分别为初始划痕宽度的（58．74±4．62）％和（34．63±2．73）％，均明显低于空白对照组和转染miR-610抑制物对照组（均P〈0．01）；转染miR-610模拟物组95D细胞划痕的宽度分别为初始划痕宽度的（88．59±6．92）％和（72．24±5．46）％，均明显高于空白对照组和转染miR-610模拟物对照组（均P〈0．01）。转染miR-610抑制物对照组、转染miR-610抑制物组95C细胞的侵袭细胞数分别为（112．4±10．6）个／空格和（161．8±12．5）个／空格，转染miR-610模拟物对照组、转染miR-610模拟物组95D细胞的侵袭细胞数分别为（178．4±12．3）个／空格和（76．7±5．8）个／空格，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。miRanda软件预测、双荧光素酶报告基因系统和Westernblot法检测结果均表明，GJA3是miR-610调控的靶基因。结论miR-610通过调控GJA3的表达抑制肺癌细胞的增殖和侵袭。