牛布鲁菌O链A抗原的提纯鉴定及种特异性单克隆抗体的研制

应用热酚法提纯牛布鲁菌544A的O链,经Sephades G-50纯化后,琼脂糖凝胶免疫扩散和SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定,用牛布鲁菌544A株全菌体免疫BALB/c小鼠,用纯化的O链筛选出4株针对O链表面A抗原的种特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株4B8、1C9、1G9和1E2,4株单克隆抗体均不与羊布鲁菌16 M、大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森菌O9、鼠伤寒沙门菌、放线杆菌发生交叉反应,具有高特异性,其中4B8的亲和常数达到了8.99×108M-1,适合用于鉴定牛种布鲁菌的研究。

狼疮静颗粒对BXSB狼疮鼠腹腔巨噬细胞Ⅰa抗原表达的调节作用

目的 探讨中药制剂狼疮静颗粒对狼疮动物模型的治疗作用机制。方法 对发病早期 (6周龄 )BXSB狼疮鼠 ,短期 (1周龄 )给予狼疮静颗粒及糖皮质激素、去甲肾上腺素等多处理因素干预 ,正交设计实验 ;流式细胞仪 (FACS)检测腹腔巨噬细胞Ⅰa抗原表达。结果 狼疮静颗粒对腹腔巨噬细胞Ⅰa抗原表达具有弱于激素的明显下调作用 (P <0 0 5 )。结论 狼疮静颗粒对系统性红斑狼疮的作用机制与调节抗原提呈细胞的MHCⅡ类分子表达 ,发挥其免疫下调作用有关。

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。

人干燥综合征A抗原重组体的构建及鉴定

目的克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-52kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原用于自身抗体的临床检测奠定基础。方法根据GenBank中检索到的人SSA-52kDcDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取人源Hela细胞总RNA作为模板,反转录RT-PCR扩增人干燥综合征SSA-52kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序;对DNA测序结果进行鉴定分析。结果RT-PCR扩增产物为1447bp。重组质粒PET-30a-SSA-52kD经BglⅡ和HindⅢ双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中检索到的一致。结论成功克隆人SSA-52kD基因,并构建重组质粒PET-30a-SSA-52kD。

人类ABO血型系统-A抗原单克隆抗体的研制

人类ABO血型的鉴捌，在临床医学、法医学、考古学及人类遗传学等工作中都是常规。传统的抗A、抗B标准血清均来自人血，全国每年用于制备ABO血型试剂所需血清量是十分可观的。应用杂交瘤技术制备血型单克隆抗体，为血型鉴别提供了新的有用工具，将为社会节省大批人血。本文报道的A抗原单克隆抗体，其生物活性稳定，可以取代传统抗A血清，作为新的血型检测试剂。

火鸡疱疹病毒A抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

火鸡疱疹病毒(HVT)感染细胞培养上清,经饱和硫酸铵沉淀,粗提HVT-A抗原,以该抗原免疫BALB/c小鼠,取三次免疫后的小鼠脾细胞,与SP_(210)骨髓瘤细胞在PEG1000作用下融合。以间接ELISA筛选阳性细胞株,获得了3株分泌抗HVT-A抗原的特异性单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。3株McAb均属于IgG_1,无荧光抗体特性和沉淀反应特性,腹水ELISA效价均在1:100000以上。以马立克氏病毒(MDV)GA株A抗原(GA-A)进行ELISA抑制试验表明,这3株McAb是针对HVT-A和GA-A相同抗原决定簇的McAb。可望应用于MDV及HVT的临床检测及分子生物学研究。

Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒的构建及鉴定

目的:构建Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒。方法:通过RT-PCR的方法从扁桃体中扩增的Mip3β基因片段,然后将基因工程合成的血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因经双酶切后分别连接至pIRES质粒,测序验证碱基序列。结果:扩增出了Mip3β的全长CDNA,并成功构建Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒,测序结果正确。结论:成功构建了Mip3β、血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因双表达重组质粒,为进一步探讨血型抗原模拟多肽对肿瘤微环境的影响奠定分子学基础。

幽门螺杆菌黏附素A抗原H-2d（I-A）限制性免疫优势Th表位的筛选与鉴定

目的鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A抗原(HpaA)H-2d限制性免疫优势Th表位,为H.pylori表位疫苗的研究提供候选表位。方法采用体外扩增的HpaA抗原特异性T细胞和步移重叠合成肽筛选鉴定HpaA抗原的免疫优势Th表位,再利用抗体阻断实验对其H-2d限制性进行分析。结果 18mer氨基酸肽段筛选发现肽段H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237能够激发HpaA特异性CD4+T细胞产生γ-干扰素。其中H154-171激发的应答最强。13mer氨基酸短肽鉴定结果显示:仅H158-170能刺激产生强于18mer氨基酸短肽H154-171的应答反应。同时,抗体阻断试验结果表明:抗H-2d(I-A)抗体能有效阻断该表位激发的应答。结论 H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237是HpaA的小鼠H-2d限制性Th表位,其中H154-171为免疫优势表位肽,该表位的核心氨基酸序列为H158-170,并存在H-2d(I-A)限制性。该研究将为H.pylori表位疫苗研究提供了可能的候选分子。

ABO血型A201等位基因表达A抗原活性的分析

目的研究ABO血型A201等位基因表达A抗原活性。方法运用血型血清学方法对1家2代3人的唾液及血液标本的ABO血型进行检测;运用Identifiler法医基因分析试剂盒作为亲缘关系鉴定;PCR扩增ABO基因后,对所有外显子做DNA测序分析,运用PCR-RFLP法进行同步检测A201等位基因中的序列变异。结果亲缘关系鉴定在Identifiler的15个遗传标记系统中显示,父母可以将所有的等位基因提供给子女,确定具有亲缘关系;然而运用不同来源的3份抗体对ABO血型进行检验时,却出现了正定型否定了母子关系,反定型无法排除母子关系的现象。3个标本ABO基因的测序:父、母、子的基因型分别为O01/O01、A201/B101及A201/O01,符合反定型结果,这就说明A201等位基因在A表型及AB表型中表达的A抗原活性差异显著。运用PCR-RFLP法可将A201等位基因中的2个主要变异点1059-1061del C和467C/T。结论 ABO血型A201基因在AB及A表型中表达A抗原活性,可由于检测抗体不同出现一定的差异;基因测序与PCR-RFLP法进行同步分析能够快速简便的鉴定A201等位基因中的1059-1061del C和467C/T。

舍格伦综合征A抗原（SSA60）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及胶体金快速检测方法的建立

目的在巴斯德毕赤酵母中表达舍格伦综合征A抗原（SSA60）并建立胶体金快速检测方法。方法表达质粒pPIC9k—SSA60用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和斑点免疫金渗滤法（DIGFA）鉴定。结果表达产物SSA60的分子量约60000，高拷贝巴斯德毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的，表达量占分泌总蛋白60％以上，产物浓度为600～950mg／L。DIGFA检测85份舍格伦综合征（SS）患者血清和30份正常人血清，抗SSA检测阳性率为95．3％（81／85），特异度为100％（30／30）。与德国欧蒙ENA酶斑点法对比检测的符合率为96．5％（111／115），差异无统计学意义（P〉O．05）。结论SSA60在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，DIGFA简便、快速、准确，可用于临床自身免疫病的诊断。

急性髓系白血病致A抗原减弱1例

白血病患者由于ABO血型抗原减弱而导致血型改变的确切机制尚未明确,在临床输血中对我们的血型鉴定等工作带来很大的困难。现将一例由于白血病导致的ABO血型抗原减弱并在病情好转后抗原表达恢复正常的病例报道如下。病例资料1病例简介患者,男,48,已婚,2014年5月因无明显诱发出现双下肢散在出血点,且反复出现,后出现双下肢瘀斑,至我院门诊就诊。

人干燥综合征A抗原克隆表达与重组蛋白及其临床应用研究

克隆人干燥综合征A抗原基因(SSA-60kD),为SSA抗原的表达和使用重组抗原建立ELISA法用于自身抗体的临床检测。根据GenBank中检索到的人SSA-60kD cDNA序列,在5’和3’非编码区设计特异性引物,提取人源HeLa细胞总RNA作为模板,经RT-PCR扩增SSA-60kD抗原cDNA。PCR产物纯化后连接至载体PET-30a,导入大肠杆菌DH5α,构建重组质粒PET-30a-SSA-60kD。对后者进行酶切鉴定、测序和分析。在大肠杆菌中表达,产生重组融合蛋白。RT-PCR扩增产物为1632bp。PET-30a-SSA-60kD经EcoR I和V双酶切证实含目的基因片段。序列分析提示与GenBank中一致。利用金属螯合亲和层析法和纯化,得到了高纯度的SSA-60kD重组蛋白。成功克隆人SSA-60kD基因,并构建PET-30a-SSA-60kD,建立了ELISA方法,检测了风湿病患者血清中抗SSA-60kD自身抗体。

MICA抗原与移植免疫

MICA （major histocompatibility complex class I chain-related gene A）基因是MIC基因家族的一个成员．表达MICA抗原。MIC是非经典的HLA—I类链相关基因家族。位于6号染色体．MICA和MICB为其功能基因，两者有80％的同源性。最近的研究发现，MICA抗原在移植免疫中作用重大。本文就MICA抗原的分子结构、多态性、表达及其与细胞免疫、体液免疫的关系等方面作一综述。

单克隆抗体SC_3A抗原在胃癌前病变中的表达与临床意义

应用本院制备的单克隆抗体SCIA及ABC免疫组化法,检测了84例胃粘膜异型增生的SC_3A-Ag表达情况,结果35例呈阳性表达(41.7%)。对其中39例进行了6～72个月(平均24个月)的随访,SC_3A-Ag阳性组20例中有9例癌变(45%),阴性组19例中有1例癌变(5.3%),两组癌变率差异有显著意义(P<0.05)。这表明SC_3A-Ag表达阳性的异型增生与胃癌关系密切,对这些病人密切随访,有助于胃癌的早期发现。

子宫内膜癌组织中SC3A抗原和雌激素与孕激素受体的检测及意义

为探讨子宫内膜癌组织中抗人大肠癌相关抗原MAb SC3A及雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)表达的意义,用免疫组化方法检测66例子宫内膜癌组织中SC3A抗原的表达。并与ER和PR的表达水平进行比较。结果显示,在66例中阳性表达率分别为81.896(54/66)、56.1%(37/66)和53.096(35/66)。29例非典型子宫内膜增生病变和31例正常子宫内膜SC3A阳性率分别为51.796(15/29)和12.996(4/31)。结果表明,子宫内膜癌组织中SC3A抗原的表达率明显高于ER和PR,同时也高于子宫内膜非典型增生病变和正常子宫内膜组(P<0.05)。结论:SC3A抗原检测对子宫内膜癌的诊断和研究具有一定应用价值。

胃粘膜SC_3A抗原表达与形态分级对异型增生癌变的联合判断价值

胃粘膜异型增生是重要的癌前病变。随访研究表明，其癌变率可达４．０％～１９．０％〔１、２〕。虽然传统的形态分级为判断其癌变的性质提供了重要依据，但判定标准常带主观性，且癌变与异型程度常不完全一致〔２〕。本研究目的是通过ＭｃＡｂＳＣ３Ａ、ＡＢＣ免疫组化法...

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

研究目的对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。方法参考GenBank上公布的TGEVS基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoRI和XholI对表达载体PET-32a(+)和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a(+)多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因A抗原位点的原核表达载体。结论TGEVS基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。