三氧化二砷对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖及新癌基因PPO表达的影响

目的探讨三氧化二砷对人恶性黑素瘤A375细胞株细胞周期、增殖、凋亡及新癌基因PPO(proliferation and phosphorylation oncogene)表达的影响。方法培养人恶性黑色素瘤A375细胞株,采用MTT法检测三氧化二砷在不同浓度和不同时间下对A375细胞增殖的影响,流式细胞术分析三氧化二砷对细胞周期及凋亡的影响,倒置相差显微镜观察药物处理后对人A375细胞的细胞分化及形态的影响,免疫细胞化学(SP)法检测三氧化二砷对PPO蛋白表达的影响。结果 MTT法证实三氧化二砷在1～10μmol/L浓度范围内对A375细胞有明显的增殖抑制作用,呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。流式细胞术检测发现,随着药物浓度的增加,G0/G1的细胞逐渐减少(P<0.01),S期的比例显著增加,出现S期阻滞。倒置显微镜观察发现细胞出现典型凋亡细胞形态学改变。免疫细胞化学法检测PPO蛋白主要表达于A375细胞胞浆内,染色呈棕黄色。三氧化二砷作用48 h后,随着药物浓度的增加,PPO的染色程度逐渐减弱,差异具有显著性(P<0.01)。结论三氧化二砷能够显著抑制A375细胞株增殖,并诱导凋亡发生,且与三氧化二砷的浓度和作用时间成正相关,其作用机制可能是通过下调新癌基因PPO的表达发挥作用。

甘草素通过调控miRNA抑制人黑色素瘤A375细胞的侵袭转移

目的 :探讨甘草素对人黑色素瘤A375细胞侵袭转移的抑制作用及与miRNA相关调控机制。方法 :不同浓度甘草素处理24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活情况,确定甘草素对细胞无毒作用剂量;通过划痕试验和Transwell小室迁移、侵袭试验分别观察细胞的非定向迁移力和定向迁移侵袭力;miRNA芯片筛选差异表达的miRNA,q PCR方法验证hsa-miR-4534和hsa-miR-4487的下调表达;Western blot检测PTEN、p-AKT、AKT、MMP2和TIMP2蛋白表达。结果:10~100μmol/L剂量甘草素处理A375细胞24 h对细胞无明显损伤作用,划痕试验、Transwell小室迁移试验、侵袭试验显示甘草素能抑制A375细胞侵袭转移;甘草素可下调hsa-miR-4534和hsa-miR-4487的表达,上调PTEN、TIMP2表达水平,降低p-AKT、MMP2的表达水平。结论:甘草素通过下调hsa-miR-4534和hsa-miR-4487表达,进而上调PTEN和TIMP2靶基因的表达水平,阻碍p-AKT信号通路并降低MMP2蛋白表达,从而发挥抑制人黑色素瘤A375细胞侵袭和转移的作用。

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对A375细胞增殖及乙酰肝素酶蛋白表达的影响

目的观察乙酰肝素酶反义寡核苷酸(ASODN)对人恶性黑素瘤A375细胞增殖及乙酰肝素酶蛋白表达的影响。方法以空白组和无关序列(N-ODN)组为对照,设计、合成4条ASODN链(ASODN-t1,t2,t3和t4),脂质体包埋后分别以10μmol/L、20μmol/L、30μmol/LN-ODN和ASODN转染A375细胞,台盼蓝排斥试验检测细胞增殖情况,免疫组织化学法检测乙酰肝素酶蛋白表达的变化。结果转染72h后,各ASODN组A375细胞计数较对照组、N-ODN组均减少(P均=0.000);每条链的10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L3个浓度组相比,差异均有统计学意义(P均=0.000);30μmol/LASODN-t2组与其他各组相比,差异均有统计学意义(P均<0.05)。转染48h后,30μmol/LASODN-t2组乙酰肝素酶蛋白的表达较对照组、N-ODN组下调(P均=0.000)。结论乙酰肝素酶ASODN可抑制A375细胞增殖,下调乙酰肝素酶蛋白的表达。

补骨脂素对A375细胞黑素合成及相关细胞信号通路调控的研究

目的研究补骨脂素对A375细胞黑素合成的影响以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的作用。方法将补骨脂素作用于A375细胞,采用MTT法检测细胞活性;Na OH裂解法检测黑素量;多巴氧化法检测酪氨酸酶(TYR)活性;RT-PCR法测定TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1和酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-1、TRP-2)以及ERK1、ERK2、JNK2这3个MAPK信号通路关键蛋白激酶的m RNA表达。结果补骨脂素在安全剂量下可显著抑制A375细胞黑素合成及TYR活性,1滋mol·L-1补骨脂素能明显下调A375细胞TYR、TRP-1、TRP-2以及ERK1、ERK2、JNK2 m RNA表达。结论推测补骨脂素通过抑制ERK1、ERK2、JNK2的表达来抑制TYR活性和/或下调TYR、TRP-1及TRP-2 m RNA表达,抑制A375细胞的黑素合成。

大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷对皮肤黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制研究

目的:研究天然产物大黄素甲醚8-O-β-吡喃葡萄糖苷(PG)对皮肤黑色素瘤A375细胞凋亡的影响及机制。方法:以0、10、20、50μg/mL的PG作用于A375细胞24、48、72 h后,采用CCK-8法测定细胞的存活率;以0(对照)、20、50μg/mL的PG作用于A375细胞48 h后,通过流式细胞仪以膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡率;免疫印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的蛋白表达以及细胞色素C在线粒体内外的蛋白表达;以0(对照)、5、10μmol/L的PG作用于A375细胞48 h后,采用酶底物法测定细胞中Caspase-8、Caspase-9的活性。结果:PG能有效降低A375细胞的存活率;与对照比较,20、50μg/mL的PG作用后细胞凋亡率明显升高(P<0.01),细胞中Caspase-3、PARP及细胞基质中细胞色素C的蛋白表达均明显增强(P<0.05或P<0.01),线粒体中细胞色素C蛋白表达明显减弱(P<0.05或P<0.01);5、10μmol/L的PG作用后细胞中Caspase-9活性明显增强(P<0.05或P<0.01),Caspase-8活性无明显变化。结论:PG能抑制A375细胞活性、促进细胞凋亡;其是通过破坏线粒体膜电位、促进细胞色素C外流来发挥促凋亡作用的。

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P<0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。

白桦脂醇对A375细胞黑素合成及p38-MAPK信号通路调控机制的研究

目的:研究植物雌激素成分白桦脂醇对黑素合成中关键限速酶、MAPK信号通路调控作用。方法:使用NaOH裂解法、多巴醌氧化法检测黑素含量及酪氨酸酶活性,Western blot和PCR法测定MAPK通路中关键蛋白激酶和TYP、TRP-1、TRP-2、MITF、p38、p-p38蛋白含量及mRNA表达;加入p38信号通路阻断剂(SB203580)之后,测定上述蛋白和mRNA表达。结果:白桦脂醇对A375细胞黑素含量和酪氨酸酶活性有抑制作用(P<0.05或P<0.01),SB203580(10μmol/L)能阻断白桦脂醇对A375细胞黑素含量和酪氨酸酶活性抑制作用;白桦脂醇对A375细胞中上述蛋白及mRNA表达有抑制作用(P<0.05或P<0.01),加入SB203580后,阻断p38-MAPK信号通路,白桦脂醇以上作用受到显著抑制(P<0.05或P<0.01)。结论:表明白桦脂醇通过MAPK信号通路中的p38-MAPK信号通路抑制A375细胞黑素合成。

驱虫斑鸠菊提取物抑制恶性黑色素瘤A375细胞增殖的研究

目的探讨驱虫斑鸠菊提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖以及对其酪氨酸酶活性和黑色素含量的影响。方法四甲基噻唑氮蓝比色法测定对A375细胞抑制作用;显微法观察细胞形态;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量。结果在一定质量浓度范围(1～40mg.L-1)内随着驱虫斑鸠菊提取物质量浓度增加可抑制黑色素瘤细胞的增殖;驱虫斑鸠菊提取物质量浓度小于10mg.L-1,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加的趋势;大于20mg.L-1时,显示一定的细胞毒性作用。结论驱虫斑鸠菊提取物能显著抑制恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,在一定质量浓度范围内(1～40mg.L-1)有浓度依赖关系(P<0.05)。

补骨脂酚对人A375细胞黑素生成及MAPK信号通路干预作用研究

目的探讨补骨脂酚抑制A375细胞的黑素合成效果及对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的干预作用。方法体外培养A375细胞,经不同浓度的补骨脂酚(100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、10^(-1)μmol/L、10^(-2)μmol/L、10^(-3)μmol/L)干预后,采用MTT法和多巴氧化法检测细胞增殖率和酪氨酸酶(TYR)活性;氢氧化钠裂解法检测黑素含量的变化;RT-PCR法测定酪氨酸酶及相关蛋白(TRP-1、TRP-2)和MAPK通路相关蛋白激酶JNK2、ERK1、ERK2 mRNA的表达量。结果与空白组比较,补骨脂酚(10^(-1)μmol/L、10^(-2)μmol/L、10^(-3)μmol/L)对黑素合成率和TYR活性均明显降低(P<0.05,P<0.01),补骨脂酚(10^(-1)μmol/L)对TYR、TRP-1、TRP-2、JNK2、ERK1、ERK2的mRNA基因表达量均显著抑制(P<0.05,P<0.01)。结论补骨脂酚对A375细胞黑素合成及TYR活性有抑制作用,其变化可能是通过下调TYR、TRP-1、TRP-2、JNK2、ERK1、ERK2的mRNA基因表达量来实现的。

补骨脂注射液联合NB-UVB对人黑素瘤A375细胞增殖及黑素合成的影响

目的通过观察补骨脂注射液联合窄谱中波紫外线(NB-UVB)对人黑素瘤A375细胞的增殖、黑素的合成以及酪氨酸酶活性的影响,探讨两者协同治疗白癜风的可能机制。方法选择一定浓度的补骨脂注射液(稀释后浓度为0.5%)联合一定剂量的NB-UVB(22m J/cm2)共同作用于人黑素瘤A375细胞后,通过MTT法观察其对人黑素瘤A375细胞细胞增殖的影响,Na OH裂解法测定黑素的含量,多巴氧化法测定酪氨酸酶活性的变化。结果补骨脂注射液+NB-UVB组中A375细胞培养至48h,72h后检测到的细胞增殖情况与单一补骨脂注射液组、NB-UVB组及空白组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。补骨脂注射液+NB-UVB组均显示可上调细胞内酪氨酸酶的活性及黑素的生成量,且与各实验干预组及空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论一定浓度的补骨脂注射液(稀释后浓度为0.5%)联合一定剂量的NB-UVB(22m J/cm2)可以协同促进人黑素瘤A375细胞的增殖,上调细胞酪氨酸酶活性,从而达到促进黑素合成的效果。

miR-182靶向作用环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1调控人黑素瘤A375细胞的增殖和侵袭

目的探讨miR-182对人皮肤黑素瘤细胞系A375细胞的增殖与侵袭能力的影响,及miR-182影响黑色素细胞增殖的机制。方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-182模拟物或抑制剂转染人黑素瘤A375细胞,以使miR-182过表达或低表达,采用MTT方法检测细胞活力变化,应用Transwell小室法检测A375细胞侵袭能力的变化,同时通过Real-time PCR检测核转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1(CREB1)mRNA的表达情况,采用Western blotting检测CREB1蛋白的表达水平。结果与对照组相比,miR-182沉默能够显著增强A375细胞增殖和侵袭能力,P<0.01,显著降低CREB1蛋白与mRNA的表达水平,P<0.01;miR-182过表达的作用与之相反。结论 miR-182沉默增强A375细胞增殖和侵袭能力可能与降低CREB1蛋白相关。

三氧化二砷诱导A375细胞凋亡过程中的信号传导途径研究

背景与目的:探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)在诱导人黑素瘤A375细胞凋亡中,对NF-κB、C-IAP2以及Caspase-3信号传导途径的影响。材料与方法:将As2O3和Caspase-3抑制剂Ac-devd-cho单独或联合作用A375细胞后,采用Western blot法检测NF-κB p65和Caspase-3表达水平,免疫组织化学法检测Caspase-3蛋白的表达,RT-PCR法检测C-IAP2mRNA表达。结果:5.0μmol/L As2O3单独处理A375细胞12h和24h以及As2O3联合Ac-devd-cho处理24h组,随着As2O3作用时间的延长,Caspase-3激活蛋白增多、NF-κB p65核蛋白和C-IAP2mRNA表达下降,Ac-devd-cho能够阻断Caspase-3蛋白的活化,而对NF-κBp65核蛋白和C-IAP2mRNA表达无明显影响;免疫组织化学法也显示,Caspase-3激活型蛋白随着As2O3作用时间的延长而增高,但能被Ac-devd-cho阻断。结论:As2O3可诱导A375细胞凋亡,能抑制A375细胞NF-κB、C-IAP2基因的表达,且不被Ac-devd-cho所阻断;As2O3能活化Caspase-3蛋白表达,而此效应可被Ac-devd-cho阻断。推测NF-κB_C-IAP2-Caspase-3通路可能是As2O3诱导A375细胞凋亡的途径之一。

siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞中HOXB7基因的干涉作用研究

目的:观察靶向siRNA抑制恶性黑色素瘤细胞株A375同源盒基因HOXB7表达后,对相应生长因子bFGF表达水平及A375细胞生物学特性的影响。方法:根据HOXB7基因设计3条序列特异性的siRNA(si-HOXB7-1,si-HOXB7-2,si-HOXB7-3),在脂质体Lipofectamine2000的介导下转染A375细胞,采用RT-PCR和FCM法来观察HOXB7及bFGF的基因沉默效应。MTT法检测A375细胞体外增殖活性。结果:3条siRNA均能不同程度地下调A375细胞HOXB7表达水平,第3条序列能更有效地封闭HOXB7基因,而空转组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:靶向HOXB7基因的siRNA可有效沉默HOXB7基因及其调控的基因bFGF的表达,并控制恶性黑色素瘤细胞的生长。

维A酸对人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的影响

目的:研究维A酸(RA)抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞增殖的作用.方法:用RA(atRA,13cisRA和9cisRA)、MA(RXR激动剂)及TTNPB(RAR激动剂)处理培养的人类恶性黑色素瘤A375细胞.用MTT法研究这些试剂对细胞增殖的影响,用流式细胞仪研究这些试剂对细胞周期的影响.结果:RA和TTNPB均可抑制A375细胞的增殖,而MA无此作用.在作用24h时的不同浓度(10-5,10-6和10-7mol/L)以及作用48和72h的10-5mol/L浓度时,TTNPB的抑制增殖作用均强于其它试剂处理组(P<0.05).细胞周期分析结果显示RA和TTNPB均可诱导A375细胞G0/G1期阻滞,而MA无此作用.在作用24和48h时的10-5mol/L浓度时,TTNPB的诱导G0/G1期阻滞作用均强于其它试剂处理组(P<0.05).结论:RA可抑制人类恶性黑色素瘤A375细胞的增殖,并诱导G0/G1期阻滞.RA的这些作用与RXR的激活无关,而可能与RAR的激活有关.

三叶青脂溶性提取物对A375细胞增殖及黑色素合成的影响

目的探讨三叶青三氯甲烷提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。方法采用MTT比色法,测定不同浓度三叶青三氯甲烷提取物对A375细胞体外抑制作用;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量;采用光学显微镜法观察其对细胞形态的影响。结果三叶青三氯甲烷提取物在6～500μg/ml浓度范围内对A375细胞增殖有显著的抑制作用(P<0.01),且呈时间-剂量依赖性;浓度小于50μg/ml时,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加趋势;在100～500μg/ml时,对A375肿瘤细胞有较强的抑制作用;光学显微镜下可见典型凋亡细胞形态学改变。结论三叶青三氯甲烷提取物对A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成具有抑制作用。

全反式维甲酸对恶性黑素瘤A375细胞增殖及Fas蛋白表达的影响

目的观察全反式维甲酸(ATRA)对体外培养恶性黑素瘤A375细胞增殖的抑制作用并探讨其作用机制。方法设置溶剂对照及ATRA不同浓度组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ATRA不同浓度、作用不同时间各组细胞存活和生长情况,分析量效、时效关系;Western blot检测10μmol/L ATRA作用不同时间Fas蛋白的表达。结果 ATRA在0.01～0.1μmol/L浓度对A375细胞增殖抑制作用不明显;在1～100μmol/L浓度有抑制作用;药物作用72 h时各浓度组的细胞抑制率均达到高峰,以100μmol/L浓度组抑制率最高;10μmol/LATRA可上调A375细胞Fas蛋白的表达。结论 ATRA对A375细胞增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖关系。ATRA可能通过Fas信号转导途径诱导A375细胞凋亡。

黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响

目的:探讨黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞株体外增殖的抑制作用。方法:选用人黑色素瘤A375细胞进行体外培养,以不同浓度的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞,连续6天使用倒置显微镜进行观察,计数,绘制生长曲线;以不同浓度(0.1～50μmol/L)的黄芩苷分别处理黑色素瘤A375细胞细胞24、48、72h后,用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:生长曲线及MTT法显示黄芩苷对黑色素瘤A375细胞有抑制作用,并呈剂量和时间依赖性;流式细胞仪检测到细胞在黄芩苷作用后,细胞凋亡率增加。结论:黄芩苷对人黑色素瘤A375细胞具有明显抑制作用,细胞凋亡可能是其机制之一。

三叶青提取物对A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响

目的探讨三叶青乙醇提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响。方法 采用MTT比色法,测定不同浓度三叶青乙醇提取物对A375细胞体外抑制作用;比色法测定酪氨酸酶活性和黑色素含量。结果在质量浓度为1～625μg/ml范围内,随着三叶青乙醇提取物浓度增大可抑制A375细胞的增殖(P<0.01);三叶青乙醇提取物浓度在1～5μg/ml时,对酪氨酸酶活性和黑色素合成抑制有增加趋势;而在25～625μg/ml时,对A375细胞有一定毒性。结论三叶青乙醇提取物在一定浓度范围内(1～625μg/ml)能抑制A375细胞的增殖,且呈剂量依赖关系。

miR-146a对人黑色素瘤A375细胞增殖和侵袭的影响及作用机制

目的探讨微小RNA-146a(miR-146a)对人黑色素瘤A375细胞增殖与侵袭能力的影响及可能机制。方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-146a模拟物或抑制剂转染入黑色素瘤A375细胞,使miR-146a过表达或低表达,采用MTT检测细胞活力变化,应用Transwell小室法检测A375细胞侵袭能力的变化。根据生物信息学软件预测FBXL10为miR-146a的下游靶基因,双荧光素酶报告分析进行验证。分别采用实时qPCR与Western blotting检测转染后各组A375细胞FBXL10 mRNA与蛋白的表达水平。结果与对照组比较,miR-146a模拟物能够显著抑制A375细胞增殖和侵袭能力(均P<0.05)。双荧光素酶报告分析结果显示,FBXL10为miR-146a的下游靶基因,miR-146a过表达可显著降低FBXL10蛋白与mRNA的表达水平;miR-146a抑制剂的作用则与之相反。结论miR-146a过表达能够抑制A375细胞增殖和侵袭能力,其作用机制可能与降低FBXL10表达相关。

黄芩素对A375细胞黑素合成的抑制作用及相关细胞信号通路调控的初步研究

目的研究黄芩素对体外培养的A375细胞黑素合成的影响及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路与该作用的相关性。方法用黄芩素处理A375细胞,采用四甲基噻唑蓝（MTT）法测定A375细胞的活性,Na OH法测定黑素量,多巴氧化法测定酪氨酸酶（TYR）活性,RT-PCR法测定TYR、酪氨酸酶相关蛋白-1（TRP-1）和TRP-2以及MAPK信号通路关键蛋白激酶ERK1、ERK2、JNK2的m RNA表达。结果 0.1-0.001μmol/L的黄芩素可明显抑制A375细胞黑素合成及TYR活性,0.1μmol/L黄芩素明显下调A375细胞TYR、TRP-1、TRP-2 m RNA表达,以及ERK1、ERK2、JNK2 m RNA表达。结论黄芩素具有抑制A375细胞的黑素合成的作用,其机制可能与抑制TYR活性和/或下调TYR、TRP-1及TRP-2 m RNA表达,以及抑制ERK1、ERK2、JNK2的表达有关。