生长分化因子11激活PI3K/Akt信号途径促进糖尿病小鼠ADSCs体外矿化的研究

目的探讨生长分化因子11(GDF11)对糖尿病小鼠来源的脂肪间充质干细胞(ADSCs)成骨分化的影响及信号机制。方法分离、培养糖尿病小鼠ADSCs。流式细胞术检测GDF11对ADSCs增殖的影响。成骨诱导培养后,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,实时荧光定量PCR(qPCR)检测成骨相关基因的表达,Western blot检测PI3K、Akt的磷酸化水平。结果GDF11不影响ADSCs增殖,呈浓度依赖性地增强ALP活性,且具有饱和性;显著上调Runx2[(2.41±0.19)vs.(1.00±0.11)]、Osx[(1.41±0.21)vs.(1.00±0.10)]和ALP[(1.42±0.20)vs.(1.00±0.09)]的表达(P<0.05);明显提高PI3K[(2.84±0.19)vs.(1.00±0.11)]和Akt[(4.58±0.20)vs.(1.00±0.19)]的磷酸化水平(P<0.05)。而且,GDF11促进糖尿病小鼠ADSC s成骨分化的作用被PI3K抑制剂LY294002部分减弱。结论GDF11促进糖尿病小鼠ADSCs骨向分化,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。

淫羊藿诱导ADSCs成骨分化作用于骨质疏松症防治的研究进展

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种慢性、全身性骨病,伴随着老龄化社会的到来,对于该疾病防治的研究日益增多,寻找有效药物诱导脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)成骨分化是目前研究较为热点的OP防治策略。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)为调控脂肪细胞分化的关键蛋白,研究证实应用淫羊藿干预骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),能抑制PPARγ表达,从而抑制BMSCs成脂分化,促进其成骨分化。Hippo信号通路通过激酶级联控制YAP/TAZ转录辅活化因子的活性,抑制PPARγ活性,进而抑制ADSCs向脂肪细胞分化。Ajuba是细胞成脂分化的重要调节剂,是一种新型的PPARγ相互作用蛋白,在细胞增殖过程中能够限制Hippo信号通路活性。中药淫羊藿在OP防治方面具有独特的优势,前期研究发现淫羊藿可促进ADSCs成骨分化,抑制其成脂分化。在OP发病机制中,PPARγ、Hippo通路、Ajuba三者之间存在着密切的关联性。结合前期实验研究,本文旨在对中药淫羊藿作用于ADSCs防治OP的作用机制进行综述,以期为临床新药研发提供参考。

兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究

目的探讨兔脂肪来源于细胞（adipose-derived stemcells，ADSCs）作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸（polylaetic-co—glycolicacid，PLGA）／壳聚糖（chitosan，CS）支架材料的生物相容性，为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据。方法取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织，I型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养，贴壁细胞至3～5代，评价其多向分化能力。将干细胞收集重悬后，以l×10^7／mL的密度接种于多孔PLGA／CS支架，形成细胞一支架材料复合物。培养7天后，扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况，评价细胞与支架材料的生物相容性；Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布；Hochest33258检测细胞在支架上的生长情况。接种1和7天后，分别对细胞一材料复合物行AnnexinV／PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用。用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物，7天后，尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力。结果原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观，在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞。细胞接种于PLGA／CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰，扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好，并向孔隙内壁充分延伸，细胞周围形成丰富的基质成分。活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响，尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成。结论多孔PLGA／CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性，可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料。

过表达miR-191抑制猪ADSCs向脂肪细胞分化

在脂肪组织发育过程中存在许多差异表达的microRNAs(miRNAs),而miR-191是从实验室前期Solexa测序结果中筛选出的差异表达miRNAs之一.本研究对不同物种miR-191的成熟及前体序列进行同源性分析,并检测其在猪不同发育阶段各组织中的表达情况,发现miR-191的成熟及前体序列在不同物种间都非常保守,通过real-time qPCR检测发现,miR-191在猪脂肪组织不同发育阶段呈高丰度差异表达,其与Solexa测序结果一致.为了更好地研究miR-191在脂肪细胞分化过程中的功能,通过基因克隆的方法,利用Ad-Easy体系,构建过表达miR-191的腺病毒载体,转染293A细胞,成功包装出重组miR-191腺病毒并能高效侵染猪脂肪基质细胞(adipose derived stromal cells,ADSCs).通过real-time qPCR检测表明,感染重组miR-191腺病毒后的ADSCs能大量表达miR-191;油红O染色可以观察到,过表达miR-191的猪ADSCs在诱导分化后与对照组相比,脂滴明显减少.进一步研究发现,miR-191过表达的猪ADSCs中,SREBP-1C(sterol regulatory element binding protein-1C)和LPL(lipoprotein lipase)的mRNA水平显著降低,脂解关键基因HSL(hormonesensitive lipase)和ATGL(adipose triglyceride lipase)mRNA水平显著升高.同时,Western印迹结果显示,过表达miR-191的猪ADSCs在诱导分化过程中,PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)、C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteinα)和A-FABP(adipocyte fatty acid binding protein)的蛋白表达水平显著下调.实验表明,过表达miR-191抑制了猪ADSCs的分化过程.这为深入研究miR-191在猪ADSCs分化过程中的调控机制奠定基础.

ADSCs培养观察及rhBMP-2转染对其生长增殖的影响

目的观察脂肪源性干细胞(ADSCs)体外生长规律,并探讨重组人骨形态发生蛋白(rhBMP-2)转染后ADSCs增殖变化情况。方法用酶消化法从1岁龄贵州小香猪腹壁脂肪组织中获取ADSCs,进行连续传代培养,倒置显微镜下观察其相关生长特性。用细胞消化计数法和四唑盐比色法(MTT)对rhBMP-2转染ADSCs前后生长增殖情况进行比较,计算倍增时间,绘制生长曲线。结果传代后ADSCs增殖速度比原代有所增快,于第4～6代趋于稳定。细胞形态由多角形、圆形和不规则形逐渐向成纤维细胞样和梭形过渡。rhBMP-2转染后ADSCs群体倍增时间增加8～10h,但对ADSCs生长增殖无明显影响(P<0.05)。结论ADSCs在体外培养至4～6代可获得较稳定状态。并且ADSCs作为宿主细胞被转染rhBMP-2基因后未发生畸变及生长增殖明显改变,说明rhBMP-2基因修饰的ADSCs可以作为携带目的基因的种子细胞应用于再生医学研究。

ADSC外泌体通过MT1抑制矽肺炎症进展的实验研究

目的染尘巨噬细胞炎症反应是矽肺发病的重要环节,本研究拟探讨ADSC外泌体中MT1在染尘巨噬细胞抗炎反应中的具体机制,方法建立MT1蛋白过表达和功能缺失的ADSC,利用Western blot检测是否构建成功。将MT1与磷酸化NIK进行免疫共沉淀,检测MT1与磷酸化NIK存是否存在相互作用,并验证MT1蛋白表达对抑制磷酸化NF-κB P52、磷酸化NIK和磷酸化IKKα蛋白表达作用。结果成功获取老年C57B/L6小鼠的ADSC和BMSC,透射电镜和Western blot结果显示成功获取外泌体;Label-free蛋白质组学和Western blot结果显示MT1在ADSC外泌体较BMSC外泌体中高表达。结论老年C57B/L6小鼠的ADSC较BMSC外泌体含有更多的MT1,可能为老年供体来源ADSC外泌体应用于抗炎治疗提供实验依据及奠定理论基础。

猪ADSCs的成脂分化及HH通路关键基因和脂肪转录因子的时序表达

为了探讨HH信号通路在脂肪细胞分化过程中的作用机制,以猪脂肪间充质干细胞(ADSCs)为材料,经成脂诱导后,利用油红O染色观察脂肪细胞的形态变化,并检测诱导分化不同时期HH信号通路关键基因Smo、Ptc1、Gli1、Gli2以及成脂关键转录因子C/EBPα、PPARγ的表达情况。结果显示,在ADSCs细胞成脂分化过程中,脂肪细胞的数量逐渐增加,脂滴变大;Smo、Gli1、Gli2基因从第4天开始随诱导天数的增加表达量逐渐降低,而Ptc1的变化趋势与之相反;且C/EBPα、PPARγ的表达从第4天开始逐渐增加。结果表明,ADSCs细胞成脂诱导第4天HH信号通路的活性被全面启动,且随诱导天数的增加其活性逐渐降低。

ADSCs干预治疗创伤性股骨颈骨折的可行性探讨

目的:探讨脂肪间充质干细胞对临床上治疗创伤性股骨颈骨折的可行性。方法:采用脂肪间充质干细胞干预后进行HE染色观察创伤性股骨颈骨折大鼠骨折修复情况;免疫组化SP法检测创伤性股骨颈骨折大鼠骨折段组织血管内皮因子VEGF的表达情况;RT-q PCR检测创伤性股骨颈骨折大鼠骨折段组织血管内皮因子VEGF mRNA的表达情况。结果:ADSCs组相较于假手术组大鼠的骨愈合修复还有一定差距,但效果优于空白模型组。结论:脂肪间充质干细胞对骨组织细胞成骨修复起促进作用,利于创伤性股骨颈骨折大鼠的骨愈合。

ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的三维动态构建

组织工程软骨的体外构建被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的有效途径。为评估载脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)壳聚糖/明胶水凝胶支架,在体外动态构建组织工程软骨相对传统静态培养的优势,本研究用壳聚糖/明胶制备了软骨仿生支架,并检测其物理性质。在制备的水凝胶支架上以1×107cells/m L密度接种ADSCs后,分别置于转瓶及T-瓶的软骨诱导基中培养两周,通过试剂染色、代谢检测和电镜观察,考察了细胞的软骨分化能力、活性、生长分布、渗透深度、增殖及胞外基质分泌情况。结果表明,壳聚糖/明胶支架的平均孔径为118.25±19.51μm,孔隙率为82.60±2.34%,吸水率为361.28±0.47%,弹性模量为61.2±0.16 k Pa,具有良好生物相容性。ADSCs生长状态良好,可向软骨细胞分化,适于作为组织工程软骨构建的种子细胞。表征结果显示,转瓶内水凝胶支架中细胞蛋白多糖的表达更显著,细胞生长分布更加均匀,细胞外基质分泌基本填满整个支架。因此,转瓶载壳聚糖/明胶支架所提供的三维动态环境,是体外构建组织工程软骨的良好方法。

复合ADSCs／β-TCP组织工程骨与PRF修复下颌骨缺损的实验研究

目的:探讨脂肪干细胞/β-磷酸三钙(ADSCs/β-TCP)组织工程骨复合富血小板纤维蛋白(PRF)在修复下颌骨缺损中的作用。方法:新西兰大白兔27只,采用随机对照动物实验,随机分为3组,每组9只,培养家兔自体ADSCs,制备自体PRF。在每只兔子的双侧下颌骨制备下颌骨缺损模型。A组:将单纯的β-磷酸三钙(β-TCP)植入双侧下颌骨缺损区,B组:将ADSCs/β-TCP植入双侧下颌骨缺损区,C组:将ADSCs/β-TCP与PRF植入双侧下颌骨缺损区。分别于术后2、4、8周分别处死9只大白兔,并通过大体观察、X线片、以及组织切片观察下颌骨缺损的修复情况。结果:C组在2、4、8周3个时间点的成骨情况明显优于其他2组(P<0.01)。A组与B组之间的成骨情况差异无显著性(P>0.05)。结论:ADSCs/β-TCP复合物与PRF联合应用可促进下颌骨缺损的修复。

ADSCs干预快速扩张兔皮肤中α-SMA表达的实验研究

目的:探究脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)对快速扩张皮肤中反应挛缩的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响,以及对成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响。方法:选取健康新西兰大白兔肾周脂肪,分离提纯ADSCs并培养3代;建立兔扩张皮肤模型,在实验组兔扩张皮肤下注射适量ADSCs悬液进行干预,对照组注射了等量的不含血清的DMEM,按照快速扩张要求扩张;手术下获得两组兔扩张后皮肤并固定;制作切片HE染色后统计皮肤厚度,进行免疫组化染色后观察皮肤中s-SMA阳性率;将数据进行统计学分析得出结论。结果:经ADSCs干预的扩张兔皮肤与对照组相比,皮肤挛缩率更低,扩张皮肤的厚度较对照组厚,α-SMA阳性成纤维细胞率更低。结论:脂肪间充质干细胞可使扩张皮肤增厚,挛缩率降低,降低α-SMA表达,抑制肌成纤维细胞形成。ADSCs可协助提高皮瓣质量。

BMP-9/EPO双基因共转染ADSCs复合nHAC/PLA支架修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的:探讨腺病毒介导BMP-9/EPO双基因共转染脂肪干细胞(ADSCs)复合nHAC/PLA支架材料促进体内成骨的可行性。方法:分离培养兔ADSCs,利用重组腺病毒构建携带BMP-9、EPO、BMP-9/EPO基因的表达载体,并转染至兔ADSCs。14 d后,在荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况,计算病毒转染效率,采用Western免疫印迹检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白的表达。50只大白兔随机分为5组,A组为空白组,B组为单纯材料组,C组为BMP-9/nHAC/PLA组,D组为EPO/nHAC/PLA组,E组为BMP-9/EPO/nHAC/PLA组。制备兔双侧下颌骨缺损模型,按照实验分组,将转染组细胞分别与nHAC/PLA支架复合培养后植入兔下颌骨缺损处,于4、8、12周在缺损处取材进行影像学、组织学检测及扫描电镜观察,比较各组动物下颌骨缺损修复情况。采用SPSS17.0软件包对结果进行统计学分析。结果:荧光显微镜下观察,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs,转染效率为80%~93%。转染后,BMP-9、EPO及BMP-9/EPO基因和蛋白均能稳定表达。转染后的ADSCs与nHAC/PLA支架复合,其骨缺损区修复情况优于对照组,且BMP-9/EPO/nHAC/PLA组成骨情况优于其他各组。扫描电镜下见转染组骨缺损与材料结合修复情况优于对照组,BMP-9/EPO/nHAC/PLA组修复最明显。结论:BMP-9、EPO均可转染ADSCs并稳定表达。与nHAC/PLA支架材料复合后,可显著促进下颌骨缺损的修复,为骨组织修复工程提供了新的选择。

PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

目的：探讨PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑修复大鼠坐骨神经缺损的修复效果。方法：32只SD大鼠平均分成4组,无菌条件下切断右侧的坐骨神经,制成1 0衄长的大鼠坐骨神经缺损模型,A组采用PLGA神经导管连接缺损神经进行修复,B组由内置自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接,C组由内置ADSCs与自体神经组织碎屑的PLGA神经导管连接,D组采用自体神经移植方式。12周后通过对再生神经桥接体的一般观察、HE染色、免疫荧光染色、甲苯胺蓝染色来评价神经的再生情况;通过肌电图、腓肠肌的HE和Masson染色来评价神经对靶器官的再支配情况。结果：术后12周,各组的神经导管均已降解,切断神经通过神经导管向两端生长。一般观察、肌电图、组织学观察结果均提示PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织碎屑组C组的修复效果显著优于内置神经组织碎屑的PLGA神经导管组B组和空导管组A组的修复效果,但仍稍差于自体神经移植组D组。结论：PLGA神经导管联合ADSCs与自体神经组织可以比较有效地修复周围神经缺损,为周围神经缺损的修复提供了一种新的方法。

低氧条件对小鼠ADSCs膜片形成及其生物学特性的影响

目的:观察低氧条件对小鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)膜片生物学性能的影响。方法:分离培养C57/BL小鼠ADSCs并用Vit C法构建细胞膜片;氯化钴(CoCl_2)模拟体内低氧环境,q PCR和Western Blot检测HIF-1α表达;组织学染色、透射电镜观察膜片形成;q PCR检测ADSCs干性及膜片分泌功能相关基因的表达。结果:成功构建ADSCs膜片;HIF-1α的表达随CoCl_2浓度的升高而升高;低氧条件下,形成细胞膜片较薄,但膜片内细胞连接更紧密;低氧环境可增强ADSCs干性,促使ADSCs膜片合成更多黏附分子、分泌更多保护性生长因子。结论:低氧条件更利于ADSCs膜片构建、存活和生物学功能维持。

rhBMP-2和rhVEGF转染ADSCs后体外表达及诱导骨缺损成骨修复的实验研究

目的观察重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)和血管内皮生长因子(rhVEGF)转染脂肪源性干细胞(ADSCs)后的体外表达情况,并以含该转染体系的组织工程骨进行大动物负重骨缺损的修复研究。方法将外源性基因rhBMP-2和rhVEGF通过脂质体LipofectamineTM2000介导的方式转染第四代ADSCs,以G418筛选出阳性克隆并扩大培养后,用RT-PCR和SABC免疫组化法在转录和蛋白质水平观察其转染后第2天和第4周表达情况。建立小香猪自体前肢尺骨中段1.5cm骨缺损模型,分3组进行对比试验:(A组)转染了生物活性因子的ADSCs与脱细胞骨基质材料(ACBM)复合而成新型组织工程骨植入修复组;(B组)未转染生物活性因子的ADSCs复合ACBM植入修复组;(C组)未处理组。以X线和组织切片评价其修复效果。结果转基因ADSCs在转染后瞬时和4周时都可表达rhBMP-2和rhVEGF。大动物骨缺损修复实验中,前2周内3组动物均未出现明显的急性炎症反应;连续X线观察和骨切片显示:A组在术后第3个月已完全修复,且修复效果和进程明显优于B组,C组缺损则主要由纤维结缔充填。结论rhBMP2及rh-VEGF转染ADSCs后可获得4周内稳定的表达。携带该缓释体系的新型组织工程骨是一种具有显著成骨能力的优良骨缺损修复材料。

用于ADSCs增殖分化的海藻酸钙/骨粉微胶珠的制备与检测

海藻酸钙微胶珠具有良好的生物相容性、可降解、机械强度高、韧性好等优点,已被广泛应用于组织工程研究。骨粉中含有大量的羟基磷灰石及BMP等生长因子,具有良好的骨诱导活性。结合上述两种材料的优点,制备了一种复合海藻酸钙/骨粉微胶珠,并系统研究了人源脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在其中的最佳包埋密度。通过正交实验综合考虑海藻酸钠溶液浓度、氯化钙溶液浓度和骨粉密度对海藻酸钙/骨粉微胶珠机械强度及传质性能的影响,并采用液滴法制备了最优化的用于ADSCs体外增殖分化的微胶珠。结果表明,海藻酸钠溶液的浓度对微胶珠传质能力和机械强度的影响最大,CaCl2溶液浓度其次,骨粉密度的影响最小。当海藻酸钠溶液浓度、CaCl2溶液浓度和骨粉密度分别为2.5%,4.5%和5.0mg/mL时,微胶珠的性能最好。对细胞扩增倍数的比较和死活染色等检测表明,当ADSCs的初始包埋密度为5×106 cells/mL时,更适于ADSCs的扩增与分化。

ADSCs复合HA促进裸鼠背部软组织血管化的实验研究

目的:探讨ADSCs复合HA促进裸鼠背部软组织血管化的实验研究方法:根据所选材料不同,将实验分为三组,A组为ADSCs复合HA,B组为ADSCs复合脂肪颗粒,C组为单纯ADSCs,分别将3组试剂随机注射到10只裸鼠皮下,每只裸鼠各注射3个点,3个月后获取相应标本,观察相应指标。结果:①大体观察:A组组织块吸收最少,B组组织块吸收较少,C组组织块基本吸收最多;②湿重测定:A组明显高于B、C组,且差异有统计学意义(P<0.01),B组高于C组,差异有统计学意(P<0.05);③存活率比较(%):A组明显高于B、C组,且差异有统计学意(P<0.01),B组高于C组,差异有统计学意义(P<0.05);④微血管密度(MVD):A组明显高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.01),B组高于略高于C组,差异有统计学意义(P<0.01);结论:HA作为生物支架复合ADSCs可加速裸鼠软组织血管化的形成,为整形美容外科脂肪干细胞移植中生物支架的选择提供理论依据。

SOX9腺病毒过表达载体的构建及其对犬ADSCs向胰岛样细胞分化的影响

脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能,是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞。SOX9是胰腺发育调控网络中的多潜能因子,其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭。但到目前为止,SOX9在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中是否具有重要作用尚不完全清楚。本试验构建了腺病毒过表达重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy,并获得了具有感染性的腺病毒毒液,将其感染犬ADSCs,感染后4、7、10、13 d和16 d观察绿色荧光蛋白表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况。结果显示,过表达SOX 9基因的腺病毒毒液感染犬ADSCs后,出现绿色荧光蛋白表达;并在第13天细胞开始出现聚集生长现象,在第16天出现多个似胰岛样细胞团;同时检测到SOX9可外源性刺激Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK 1和PCSK 2等基因的内源性表达。表明SOX 9基因过表达腺病毒毒液可成功感染犬ADSCs,促进其向胰岛样细胞分化。

结构型PLGA/TCP/Col/ADSCs-OB仿生活性人工骨的体外构建及其在兔腰椎横突间脊柱融合的实验研究

采用先进快速成形（rapid prototyping,RP）技术构建新型仿生活性人工骨,探讨其在兔腰椎横突间融合的能力。RP制备薄块型（20mm×20mm×3mm）聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙[Poly（DL-lactic-glycolic acid）/Tricalcium phosphate,PLGA/TCP,PLGA/TCP（w/w=7：3）]多孔人工骨载体。健康新西兰兔24只被均分为A、B两组。A组：于兔腰4-5右侧及左侧横突间分别植入PLGA/TCP/Col/ADSCs-OB仿生活性人工骨（A1组）及自体髂骨（A2组）。A1组首先制备出各只兔脂肪间充质细胞来源的成骨细胞（ADSCs-OB）,再将细胞与经I型胶原（Col）表面修饰的PLGA/TCP载体复合用于自体植入。B组：于融合部位分别植入复合自体新鲜红骨髓的PLGA/TCP材料（B1组）及单纯PLGA/TCP载体（B2组）。术后12w,系统评价各组脊柱融合情况。结果表明：具有良好三维结构的PLGA/TCP载体经Col表面修饰后,对ADSCs-OB的细胞相容性显著提高。A1组仿生骨植入具有较强的成骨及骨性融合能力,且在新骨形成及其改塑的同时,载体材料逐渐降解。A2组自体髂骨移植亦能达到良好骨性融合。B1组、B2组术后12w遗有较多的载体材料有待降解,基本无骨融合现象。A1、A2、B1、B24组横突间融合率分别为75%、50%、16.7%和0%,A1组融合率最高（P〈0.01）。说明：基于先进生物制造技术构建的PLGA/TCP/Col/ADSCs-OB仿生人工骨具有良好的三维结构、生物相容性、可降解性及成骨能力,对于跨度较大的横突间节段融合表现出好的效果。

ADSCs构建皮肤复合组织修复皮肤溃疡实验研究

目的探索脂肪来源干细胞构建皮肤复合组织的方法及修复皮肤溃疡的效果。方法采用从人类包皮中分离出表皮细胞和成纤维细胞进行体外培养与鉴定,首先把成纤维细胞接种于牛胶原凝胶中培养生长构建活性真皮替代物,在裸鼠背部制做直径1cm全层皮肤缺损,将培养2周的活性真皮替代物移植于创面,观察其愈合情况;再接种表皮细胞于该活性真皮替代物中,经过气-液界面培养,表皮细胞成层并向基底上层分化形成表皮/真皮复合皮。取10 ml成人脂肪抽吸物,分离、培养和鉴定脂肪来源干细胞(ADSCs),将ADSCs作为种子细胞接种于牛胶原凝胶支架并行成脂诱导和扩增培养构建类"脂肪"组织,再把复合皮与所构建的"脂肪"组织按表皮、真皮、皮下脂肪的结构顺序"组合"培养以构建出具有多层结构的皮肤复合组织。在裸鼠背部两侧建立直径为10 mm的圆形皮肤创面模型,右侧(实验侧)创面缺损部位植入直径为10 mm的多层复合组织,左侧(对照侧)进行简单的创面包扎修复,观察两侧溃疡愈合速度和质量以及通过活检组织病理学检查比较各自的表皮、真皮、成纤维细胞、血管和脂肪组织再生情况。结果成纤维细胞接种于Ⅰ型牛胶原凝胶共同培养所构建的活性真皮替代物类似真皮,可修复皮肤缺损。在构建的活性真皮替代物上种植表皮细胞,经过气-液界面培养,表皮细胞成层分化,形成复合皮。从脂肪组织中可分离获取ADSCs,它具有多向分化潜能。ADSCs与Ⅰ型牛胶原凝胶支架在体内、外均可构建出脂肪样组织,复合皮与类"脂肪"组织参照正常皮肤结构顺序"组合"培养可构建出具有多层结构的皮肤复合组织。实验侧创面愈合率、肉芽组织厚度、真皮层厚度以及毛细血管密度显著高于对照侧。结论选择表皮细胞、成纤维细胞、脂肪来源干细胞(ADSCs)作为组织工程种子细胞,以牛胶原凝胶作为支架,能够构建出具有多层结构的皮肤复合组织,并可成功用于修复裸鼠背部皮肤全层组织缺损,具有提高愈合速度、增加愈合皮肤厚度的作用。